猪大脑皮质、海马结构、梨状叶和杏仁核内leptin长形受体mRNA的分布定位

用分子生物学的方法合成了leptin长形受体 (Ob Rb)反意和正意核酸探针 ,用原位杂交法研究了 5头 2～ 3月龄母猪端脑一些结构内Ob RbmRNA的分布定位。结果表明 ,猪Ob RbmRNA分布于大脑皮质、梨状叶、海马、齿状回和杏仁核。大脑皮质和梨状叶内的Ob RbmRNA标记神经元主要位于第Ⅱ Ⅵ层 ,分子层偶见标记神经元。海马结构内的Ob RbmRNA标记神经元主要位于海马的锥体细胞层和齿状回的颗粒层 ,在海马的始层和齿状回的多形层偶见标记神经元 ,在海马的辐射层和腔隙层罕见标记细胞。实验结果弥补了猪端脑内Ob RbmRNA分布定位资料的空白 ,为理解leptin的生理功能提供了形态学基础。

猪丘脑、小脑和延髓内Leptin长形受体mRNA的分布定位

目的 :研究猪丘脑、小脑和延髓内leptin长形受体 (longformleptinreceptor,Ob Rb)mRNA的分布定位 ,比较长白猪和眉山猪上述脑区内Ob RbmRNA分布的差异。方法 :原位杂交法。结果 :在丘脑内 ,Ob RbmRNA标记神经元几乎见于所有核团 ,在中线核、丘脑室旁核和丘脑前核内出现大量的Ob RbmRNA标记神经元 ,其余核团内Ob RbmRNA标记神经元分布较少。在小脑皮质三层中均有Ob RbmRNA标记神经元 ,以梨状神经元层和颗粒层分布较密集。在延髓下橄榄核、孤束核、迷走神经背核和舌下神经核有Ob RbmRNA标记神经元出现。结论 :猪丘脑、小脑和延髓内均有Ob RbmRNA分布 ,其分布定位在长白猪与眉山猪未见明显的差异。

Leptin长型受体与生长抑素共存于猪前脑内

目的 :研究三元杂交猪和梅山猪仔猪前脑内Leptin长型受体 (Ob Rb)mRNA与生长抑素 (SS)免疫反应阳性物质的共存关系。方法 :用原位杂交与免疫组织化学相结合的方法。结果 :Leptin长型受体mRNA和生长抑素免疫反应阳性神经元分布于下丘脑室周核、背内侧核、腹内侧核、室旁核、海马 杏仁核及大脑皮质。上述结构内一些表达Leptin长型受体mRNA的神经元也含有生长抑素免疫反应阳性物质。 结论 :两种猪前脑内Ob RbmRNA与SS免疫反应阳性物质的共存情况无明显差异。Leptin可直接作用于下丘脑的生长抑素免疫反应阳性神经元调节动物的能量代谢 生长和繁殖等活动。

Leptin长型受体与神经肽Y在猪前脑内共存

用原位杂交与免疫组织化学相结合的方法研究了 5头三元杂交仔猪前脑内leptin长型受体mRNA与神经肽Y(NPY)免疫反应阳性物质的共存关系。实验结果表明 ,leptin长型受体mRNA和NPY免疫反应阳性神经元分布于下丘脑漏斗核和前室周核、海马、杏仁核及大脑皮质。上述结构内一些表达leptin长型受体mRNA的神经元也含有NPY免疫反应阳性物质 ,即leptin长型受体与NPY共存于同一神经元内。提示leptin可能通过下丘脑漏斗核和室周核以及边缘系统的海马和杏仁核 ,甚至大脑皮质中表达leptin长型受体mRNA的NPY免疫反应阳性神经元调节动物的摄食、能量代谢、生长和繁殖等活动。

奶牛Leptin长型受体(OB-Rb)竞争RT-PCR内标物的构建

为了构建奶牛瘦素长型受体(OB-Rb)的定量PCR内标物。应用RT-PCR方法,克隆、测序287bp的OB-Rb片段,应用限制性内切酶BglⅡ插入470bp外源片段,构建了一个重组的竞争模板,为建立竞争性RT-PCR法检测奶牛瘦素长型受体mRNA奠定了基础。

用原位杂交法研究猪下丘脑内瘦素长形受体mRNA的分布定位

用体外转录方法合成了瘦素 (leptin)长形受体 (Ob Rb)反义和正义RNA探针 ,用原位杂交法研究了 5头 2～ 3月龄母猪下丘脑内瘦素长形受体mRNA的分布定位。结果表明 ,猪瘦素长形受体mRNA分布于下丘脑的弓状核、腹内侧核、背内侧核、室旁核。

瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达的影响

目的:探讨瘦素对IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞基质金属蛋白酶-13(MMP-13)mRNA表达的影响及其机制。方法:体外培养大鼠膝关节软骨细胞,取第3代细胞采用免疫细胞化学方法及甲苯胺蓝染色法鉴定Ⅱ型胶原及蛋白多糖表达;MTT法检测不同质量浓度瘦素环境下正常及IL-1β诱导软骨细胞的增殖活力;实时定量PCR法检测不同质量浓度瘦素处理后IL-1β诱导软骨细胞MMP-13 mRNA的表达,ELISA法检测培养基上清肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平;通过小RNA干扰(siRNA)抑制瘦素长型受体(OB-Rb)表达,观察瘦素对MMP-13 mRNA表达的影响。结果:所有细胞均能分泌Ⅱ型胶原及蛋白多糖。MTT结果显示,低质量浓度瘦素对细胞增殖无明显影响,瘦素质量浓度大于等于10 ng·ml-1后可显著促进细胞增殖;而10 ng·ml-1的IL-1β可显著抑制细胞增殖,同时给予100 ng·ml-1及1μg·ml-1瘦素则可进一步抑制细胞增殖,差异均有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR结果显示,IL-1β可增加软骨细胞MMP-13 mRNA表达及TNFα分泌,而加入瘦素(100 ng·ml-1)后可进一步刺激MMP-13 mRNA的表达及TNFα的分泌,差异具有统计学意义(P<0.05)。转染OB-Rb siRNA的软骨细胞OB-Rb mRNA的表达显著下降(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则不受影响;IL-1β处理对转染组OB-Rb的mRNA表达无明显影响,但可显著诱导MMP-13 mRNA的表达增加(P<0.05),进一步加入瘦素后,OB-Rb mRNA的表达有所增加,但表达量远远低于siRNA未处理组,差异具有统计学意义(P<0.05),MMP-13 mRNA的表达则未见增加。结论:一定浓度的瘦素可通过与OB-Rb结合促进IL-1β诱导大鼠骨性关节炎软骨细胞MMP-13 mRNA表达,具有降解软骨作用。

孕激素对人绒毛滋养层细胞表达ADAM10、Ob-R及分泌SLR、LEP的影响

目的探讨不同浓度孕激素对早孕人绒毛滋养层细胞表达基质金属蛋白酶10(ADAM10)、长型瘦素受体(Ob-R)及分泌可溶性的瘦素受体(SLR)、瘦素(LEP)的影响。方法培养原代人绒毛滋养层细胞,分别给予含有不同浓度的孕激素(0、100、150、200 ng/m L)培养24 h,检测细胞内ADAM10和Ob-R的相对表达量及上清液中SLR及LEP的含量。结果随着孕激素浓度的增加,早孕人绒毛滋养层细胞表达ADAM10的含量逐渐降低,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。随着孕激素浓度的增加,早孕人绒毛滋养层细胞表达Ob-R的含量逐渐增加,组间比较无统计学差异(P>0.05)。各组细胞上清液中SLR含量随着孕激素的浓度增高而逐渐降低,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。各组细胞上清液中LEP浓度随着孕激素浓度的增高而逐渐增高,组间两两比较有统计学差异(P<0.05)。采用Pearson检验发现SLR的表达与LEP的表达存在显著性负相关(R=-0.949,P<0.01)。结论孕激素可能通过影响ADAM10、SLR、LEP的表达而调控瘦素功能的发挥,参与妊娠期糖尿病(GDM)发生。

CCl_4肝纤维化大鼠功能性瘦素受体表达的动态变化

目的明确瘦素受体(OB-R)在正常和CCl4肝纤维化大鼠肝组织的表达,观察功能性瘦素受体(OB-Rb)表达在肝纤维化进程中的动态变化,以探讨瘦素在肝纤维化形成中的作用机制。方法建立大鼠CCl4肝纤维化模型,采用免疫组织化学方法观察瘦素受体在大鼠肝组织的表达及变化;采用RT-PCR方法观察大鼠肝组织OB-Rb mRNA表达的动态变化。结果正常肝组织可见OB-R在汇管区和血管周围间质细胞的胞质和胞膜有少量表达;OB-R在模型大鼠汇管区、小叶内窦周及纤维间隔的表达明显增加。正常肝组织表达OB-Rb mRNA,不同时间点其表达量差异无统计学意义;模型组造模4 d后,OB-Rb mRNA表达水平即开始增加,随着肝纤维化的形成,OB-Rb mRNA表达逐渐增强,其表达水平与肝纤维化分期呈正相关性(rs=0.804,P=0.000)。结论在大鼠CCl4肝纤维化形成过程中,功能性瘦素受体的表达在肝损伤早期即明显增加,并随纤维化程度加重而逐步升高,从而促进肝脏纤维化的发生。

小尾寒羊瘦素长型受体基因实时荧光定量PCR标准品质粒和标准曲线的构建

本试验旨在制备用于小尾寒羊瘦素长型受体(leptin receptor long form)基因实时荧光定量PCR的标准品质粒和标准曲线。提取初情期前小尾寒羊下丘脑弓状核组织总RNA,进行反转录合成第1链cDNA,然后进行PCR和目的基因片段的回收;通过T-A克隆将该基因片段插入pMD18-T载体中,构建回收产物的重组质粒;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。重组质粒经PCR扩增和测序,结果表明,瘦素长型受体基因已成功克隆。提示,所构建的瘦素长型受体基因实时荧光定量标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此方法可作为实时荧光定量PCR检测瘦素长型受体基因的标准方法。

瘦素及其受体在多囊卵巢综合征卵巢的表达及意义

目的探讨瘦素(Leptin)及其受体(Ob gene receptor,Ob-R)系统与多囊卵巢综合征(polycystic ovary syn-drome,PCOS)发病机制间的关系。方法用免疫组织化学和原位杂交技术检测Leptin、具有信号传导功能的leptin长受体(Ob-Rb)在PCOS患者(15例)和月经周期规律的对照组(20例)卵巢的表达。结果Leptin及Ob-Rb的蛋白及mRNA在PCOS患者和对照组的卵巢均有表达。②Leptin主要分布在各级卵母细胞、窦状卵泡至排卵前卵泡的颗粒细胞(granulosa cell,GC)、不同生长阶段及闭锁卵泡的卵泡膜细胞(theca cell,TC),在PCOS患者卵母细胞的表达明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。③Ob-Rb主要分布在各级卵母细胞、各级生长卵泡及闭锁卵泡的TC、次级及近成熟卵泡的GC、成熟黄体的颗粒黄体细胞。在PCOS患者的卵母细胞、窦状卵泡的TC及闭锁卵泡TC的表达显著高于对照组(P<0.01/P<0.05)。④Leptin及Ob-Rb在不同发育阶段卵巢的表达规律:卵母细胞强阳性表达,在初级卵泡的GC及TC表达较弱,随着卵泡发育表达逐渐增强,在排卵前卵泡或闭锁卵泡TC强阳性表达,Ob-Rb在发育期黄体的颗粒黄体细胞亦呈强阳性表达。⑤Leptin及Ob-Rb在PCOS患者小卵泡TC的表达高于GC,差异有统计学意义(P<0.05)。结论卵巢具有分泌Leptin的功能。②Leptin及受体系统在卵母细胞、卵泡和黄体发育、受精及受精卵着床过程中可能起重要作用。③Leptin及其受体系统在PCOS的卵巢异常表达。

四甲基吡嗪对肝纤维化大鼠肝组织中TGF-β_1、Smad3、Smad7及瘦素表达的影响

目的观察肝组织中TGF-β1、Sm ad3、Sm ad7和瘦素(Leptin)表达的变化,研究四甲基吡嗪抗肝纤维化作用及可能机制。方法SD大鼠48只,随机分为正常对照组、肝纤维化模型组、四甲基吡嗪预防组、四甲基吡嗪治疗组、葡萄糖预防组、葡萄糖治疗组。除正常对照组外,其余各组大鼠均皮下注射60%四氯化碳(0.3 mL/100 g体重,每周2次)复制肝硬化动物模型。四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组分别自造模之日起和造模开始后第31天给予四甲基吡嗪(10 mg/100 g体重灌胃,1次/d),葡萄糖预防组和葡萄糖治疗组分别于造模之日起和造模开始后第31天予5%葡萄糖(1 mL/100 g体重,1次/d)灌胃作平行对照。实验第12周取肝组织,用RT-PCR检测肝组织中瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βR II的mRNA表达水平,用W estern b lot检测肝组织中Sm ad3、Sm ad7的蛋白水平,MPIAS-500多媒体真彩色图像分析系统作肝内胶原定量分析。结果与正常组大鼠相比,模型组大鼠肝内胶原面积、肝组织中瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βR II的mRNA表达及Sm ad3蛋白增高,Sm ad7蛋白降低(P<0.01),四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组上述指标高于正常组大鼠,但均低于模型组大鼠(P<0.05,P<0.01);四甲基吡嗪预防组和四甲基吡嗪治疗组Sm ad7蛋白水平高于模型组(P<0.05),但低于正常组大鼠。结论四甲基吡嗪能有效减轻四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化作用,可能与直接或间接下调肝内瘦素、瘦素功能性受体、TGF-β1、TGF-βR II及Sm ad3表达,上调Sm ad7表达有关。

瘦素及瘦素功能性受体表达与大鼠肝硬化关系的研究

目的观察实验性大鼠肝硬化形成过程中,肝组织瘦素及瘦素功能性受体表达的动态变化以及与肝内胶原含量的关系。方法经皮下注射四氯化碳(0.3ml/100g体重,每周2次)复制肝硬化动物模型,于第0、3、6、9、12周各处死一批大鼠。用RT-PCR检测各期动物肝组织中瘦素及瘦素功能性受体(Ob-Rb)mRNA表达水平。用免疫组织化学方法检测各期动物肝组织中瘦素、瘦素受体的表碉和定位,用放射免疫法检测各期动物血浆中透明质酸(HA)、瘦素水平。运用MPIAS-500多媒体真彩色图像分析系统作肝内胶原定量分析。结果正常肝组织中有少量瘦素、瘦素功能性受体的mRNA表达,随着肝硬化的形成,各期表达量逐渐递增(与0周比较,P<0.01)。正常肝组织可见瘦素及瘦素受体在血管周围、汇管区及肝索间质细胞的细胞质和细胞膜有少量表达,随着肝硬化的形成,瘦素、瘦素受体表达增多、增强(P<0.01)。随着造模时间的增加,肝内胶原面积、血浆中HA和瘦素均逐渐增加,各期比较差异有统计学意义(P<0.05)。肝硬化形成过程中,肝脏中瘦素、瘦素功能性受体的mRNA表达水平与血浆中HA水平及肝内胶原含量呈正相关(瘦素与HA:r=0.726,P=0.00;瘦素与胶原:r=0.732,P=0.00;Ob-Rb与HA:r=0.705,P=0.00;Ob-Rb与胶原:r=0.764,P=0.00)。结论在四氯化碳诱导的大鼠肝硬化形成过程中,瘦素及功能性受体的基因和蛋白表达增加,并随肝硬化程度的加重而逐步升高,从而促进肝硬化的发生。

大鼠重组瘦素对成熟脂肪细胞细胞因子信号转导抑制因子3表达的影响

目的模拟肥胖者体内高瘦素环境,探讨瘦素处理脂肪细胞细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS-3)mRNA及蛋白表达变化。方法分离SD雄性大鼠附睾成熟脂肪细胞,RT-PCR法检测瘦素长型受体(OB-Rb)mRNA表达,并采用0.5～500nmol/L重组大鼠瘦素处理分离的成熟脂肪细胞0、0.5、2和6h,RT-PCR法检测SOCS-3 mRNA表达。免疫沉淀及Western blot检测SOCS-3蛋白表达。结果成熟脂肪细胞可表达少量的OB-Rb;未经瘦素处理的脂肪细胞SOCS-3 mRNA和蛋白只有少量表达,瘦素浓度0.5nmol/L时SOCS-3表达无明显变化,当瘦素浓度在5、50及500nmol/L时,SOCS-3表达量随时间延长而增加。结论瘦素可对脂肪细胞产生直接作用,并且可以诱导SOCS-3的表达增加。