黄颡鱼PGRP-L基因克隆及其对爱德华氏菌的反应(英文)

为了研究肽聚糖识别蛋白家族(Peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)在黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)先天免疫应答中发挥的作用,根据NCBI中斑马鱼(Danio rerio)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)PGRP-L的基因信息,采用简并引物和RACE方法从黄颡鱼肝脏中克隆得到了一个长型PGRP(Pf PGRP-L)基因.Pf PGRP-L基因的全长c DNA序列大小为1617 bp,其中5′和3′非翻译区的长度分别为135和72 bp,开放阅读框为1410 bp,编码469个氨基酸.同源性和系统进化分析表明,黄颡鱼PGRP-L与虹鳟的同源性为60%,与脊椎动物的PGLYRP2或PGRP-L聚在一起.半定量RT-PCR分析发现Pf PGRP-L基因在黄颡鱼鳃、胸腺、肝脏、脾脏、肠道、肾脏、头肾、心脏、血液和肌肉组织中均有分布,但在肠道和脾脏中的表达量较为丰富,而在肌肉和血液中表达则很少.用爱德华氏菌刺激后,Pf PGRP-L在肝脏、脾脏、肠道及头肾中的表达明显上调.结果表明,Pf PGRP-L在黄颡鱼抵抗病原菌中具有重要作用.

小鼠PGRP-L分子N端基因片段的克隆与原核表达

采用RT-PCR技术,从BALB/c小鼠肝组织总RNA中扩增到长约500bp的小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)分子N端基因片段,将其克隆入pUCm-T载体构建重组质粒pmGN,DNA测序表明该基因片段长530bp,序列与GenBank中的完全一致。应用PCR技术,从重组质粒pmGN中扩增目的基因片段,插入表达质粒pET-28a构建重组表达载体pET-GN,导入大肠杆菌BL21中诱导表达目的蛋白,表达产物以Ni+-NTAagarose层析柱纯化。SDS-PAGE和Westernblot分析发现,表达产物主要以包涵体形式存在,相对分子质量约29000。ELISA表明,重组蛋白能被抗mPGRP-L分子N端单表位多克隆抗体所识别。为mPGRP-L分子的研究奠定了一定基础。

抗小鼠PGRP-L单表位多克隆抗体的制备

目的制备抗小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)单表位多克隆抗体。方法应用生物信息学技术预测小鼠mPGRP-L分子的B细胞优势表位,人工合成抗原肽,采用MBS法将其与钥孔血蓝蛋白(KLH)偶联,免疫家兔获取mPGRP-L抗血清,采用HiTrap proteinG柱和抗原肽亲和层析柱纯化抗体,以ELISA和Western blotting进行鉴定。结果确定了位于mPGRP-L分子N端第85～104位残基的1个B细胞优势表位NH2-(C)DPHSLSPELQALISEVAQHD-COOH,合成短肽并制备KLH-肽偶联物,免疫家兔得到的抗血清效价达1∶256000。分别以HiTrapproteinG柱和抗原肽柱亲和层析纯化获得兔抗mPGRP-L单表位多克隆抗体mPGRP-Ln1和mPGRP-Ln2。纯化抗体能与重组蛋白pET-mPGRP-Ln结合,经Western blotting分析,在相对分子质量约29000处可见清晰的反应条带。结论获得抗mPGRP-L单表位多克隆抗体,为mPGRP-L分子的研究提供了工具。

小鼠长型肽聚糖识别蛋白的组织分布

采用RT-PCR、Northern blot以及免疫组织化学技术研究小鼠长型肽聚糖识别蛋白(mPGRP-L)在体内的表达情况。RT-PCR显示,mPGRP-L mRNA在肝脏、肾脏表达,在心、肺、脾、胸腺不表达;Northern blot结果表明,mPGRP-LmRNA在肝脏组织强表达,在脾脏和肾脏弱表达,在脑、心、肺、胃、骨骼肌、睾丸、胸腺、小肠不表达。组织切片免疫组织化学分析发现,肝、肾组织呈阳性结果,其余组织(心、脾、肺、脑、气管、胃、子宫、大肠、肌肉、小肠、膀胱)为阴性。本工作为研究mPGRP-L分子的生物学功能提供了重要的线索。

黄颡鱼长型肽聚糖识别蛋白(pfPGRP-L)原核表达和多克隆抗体的制备

为进一步研究肽聚糖识别蛋白(peptidoglycan recognition proteins,PGRPs)在先天性免疫应答中的生物学功能,在前期克隆黄颡鱼长型肽聚糖识别蛋白(pfPGRP-L)c DNA全长的基础上,根据pfPGRP-L基因中高亲水性区域序列设计特异性引物扩增出编码序列,将该基因片段克隆到p GEX-4T-1质粒,构建重组表达载体。SDS-PAGE电泳检测该目的蛋白大小约为51 ku,与理论值大小符合,回收蛋白并纯化,与弗氏佐剂等量混合后注射新西兰大白兔制备多克隆抗体,用ELISA和Western blotting分别检测该抗体,结果显示:抗体效价可达1∶256 000,且有特异性条带,表明pfPGRP-L的多克隆抗体制备成功。此外,Western blotting检测黄颡鱼不同组织pfPGRP-L蛋白的表达,发现在鳃、胸腺、肝脏、肾脏、头肾、脾脏、血液和肠道等不同组织中都有目的条带,而在脾脏和肠道中表达更强。为pfPGRP-L的抗菌作用和功能研究奠定基础。

小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的克隆小鼠长型肽聚糖识别蛋白(PGRP-L)的PGRP结构域基因并在大肠杆菌中表达。方法采用RT-PCR技术,从Balb／C小鼠肝组织总RNA中扩增PGRP-L的PGRP结构域基因片段,将其克隆入pUCm-T载体,以PCR、酶切和测序进行鉴定。以PCR从含PGRP结构域基因的重组质粒中扩增目的基因片段,插入表达质粒pQE-30构建重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,诱导表达并纯化目的蛋白。结果 RT-PCR扩增得到约500bp的基因片段,将其与pUCm-T 载体连接构建成重组质粒pmPGRPd,其酶切图谱与计算机分析结果一致,该基因片段长518 bp,序列与Genbank中相应基因序列相同。构建成重组表达载体pQE-PGRPd,在大肠杆菌M15中表达,表达产物主要存在于菌体裂解液上清中,为一相对分子质量约29 000的可溶性蛋白。结论成功克隆并原核表达了小鼠PGRP-L分子PGRP结构域基因,为 PGRP-L分子的研究奠定了一定基础。