漾濞大泡核桃病程相关蛋白10基因JsPR10-1的克隆与表达分析

病程相关蛋白(pathogenesis-related protein,PR)10的激活与积累在植物抗逆境胁迫中有非常重要的作用。根据漾濞大泡核桃(Juglans sigillata)编码PR10的EST(expressed sequence tag)序列设计引物,利用快速扩增c DNA末端技术,克隆得到PR10基因的全长c DNA序列,并命名为Js PR10-1。Js PR10-1全长c DNA为776 bp,含有483 bp的开放阅读框、74 bp 5'-非编码区以及219 bp 3'-非编码区,编码含有160个氨基酸的蛋白质。全长基因序列中含有1个124 bp的内含子。Js PR10-1编码的蛋白质与栎树(Quercus suber)、欧洲山毛榉(Fagus sylvatica)以及欧洲板栗(Castanea sativa)的PR10相似性较高,并且在PR10的系统进化树中与双子叶植物聚为一支。qRT-PCR分析结果表明,植物信号分子水杨酸、茉莉酸、乙烯以及过氧化氢处理均可诱导Js PR10-1表达。在接种胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)后,Js PR10-1的表达量迅速上升并在接种8 h时达到最大值,表明Js PR10-1参与漾濞大泡核桃对胶孢炭疽菌的防卫反应。本研究为揭示漾濞大泡核桃抗性机制奠定了理论依据。

枸杞抗炭疽病菌毒素愈伤组织变异体的离体筛选及其防御酶活性研究

以枸杞炭疽病菌粗毒素液作为选择剂,将体细胞无性系变异与辐射诱变相结合,对宁夏枸杞主栽品种"宁杞1号"的叶片胚性愈伤组织进行辐射诱变和筛选,以期获得稳定的抗炭疽病细胞变异系。结果表明,以半致死剂量的60Coγ对枸杞叶片诱导出的胚型愈伤组织进行辐照处理,将其恢复增殖后,采用多步正选择法结合加压与去压交替的筛选方法,筛选到了抗性愈伤组织变异体,其在不同粗毒素浓度胁迫下,其鲜重增长均高于对照组,而且在离开选择因子继代培养4代后,仍保持获得的抗性。分析抗性系与抗病相关的防御酶的活性表明,无论有无粗毒素胁迫,抗性愈伤组织变异体的PAL、POD和PPO酶活性均高于对照愈伤组织;在粗毒素胁迫下,随着粗毒素浓度的增大,3种酶活性基本呈先升高后降低的趋势,抗性变异系3种酶活性的上升幅度较对照组要大,而PAL和POD活性的下降速度较对照亲本系小,说明抗性变异系通过增强与抗病性相关酶的活性,来加强同植物防卫有关的物质代谢。

漾濞大泡核桃JsWRKY1过表达增强转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性

为进一步研究JsWRKY1的生物学功能,构建JsWRKY1的植物超表达载体并转入烟草中过表达。再生的JsWRKY1转基因烟草与野生型烟草在表型上无明显差异。JsWRKY1过表达上调了转基因烟草体内几个防卫相关基因MnSOD、Cu/Zn SOD、CN、NADPH oxidase和PR1的转录水平。与野生型烟草相比,JsWRKY1转基因烟草体内的超氧化物歧化酶、过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶活性在正常生长以及胶孢炭疽菌接种后均显著增强。平板抑菌试验结果显示,JsWRKY1转基因烟草叶片总蛋白对病原真菌葡萄座腔菌、串珠状赤霉菌、胶孢炭疽菌和尖孢镰刀菌的菌丝生长具有不同程度的抑制作用。此外,用胶孢炭疽菌接种烟草叶片,转基因烟草对胶孢炭疽菌的抗性明显增强。显然,JsWRKY1是漾濞大泡核桃中正调控病害防卫反应的转录因子。

炭疽病菌侵染对枇杷果实病程相关酶活性的影响

对采后枇杷果实接种炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides),研究测定一些与病程相关酶活性的变化。结果表明:接种炭疽病菌的枇杷果实过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性明显升高,均于接种后第2天达到一个活性高峰,而POD于第5天出现了第二个活性峰,并且这两种防御酶的峰值出现时间基本与明显病斑显症时期一致;真菌细胞壁降解酶β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性都于第3天出现一个活性高峰,β-1,3-葡聚糖酶活性增幅高于几丁质酶。

采后柑橘与胶孢炭疽菌互作过程中果皮成分的动态变化

目的：探究柑橘胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）侵染过程中柑橘果皮细胞壁降解相关酶（cell wall degrading enzymes,CWDEs）、细胞壁成分和防御相关酶活性的动态变化,为进一步研究胶孢炭疽菌致病机理提供理论参考。方法：柑橘果实接种胶孢炭疽菌后,不同培养时间取样测定,并比较分析果皮成分变化。结果：胶孢炭疽菌侵染的柑橘组织中均能产生多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果胶甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、纤维素酶（Cx）、β-葡萄糖苷酶（β-Glu）、角质酶,且均在侵染前期（1-3 d）达到峰值。纤维素、半纤维素、果胶等细胞壁组分含量随胶孢炭疽菌的侵染而降低,木质素含量随胶孢炭疽菌的侵染而升高。胶孢炭疽菌侵染后,柑橘组织中的过氧化物酶（POD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性、丙二醛（MDA）含量总体呈上升趋势。结论：CWDEs和角质酶在炭疽病发病前期起到重要的致病作用,其对果皮细胞壁组分的降解加速了胶孢炭疽菌的侵入;另外胶孢炭疽菌的侵染加速了寄主细胞质膜的过氧化。

拮抗砀山梨炭疽菌的内生菌筛选及抑菌效果分析

从健康砀山梨中分离出15株内生菌,筛选出1株对砀山梨胶孢炭疽菌抑菌活性较高的菌株,命名为DSL-9,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。DSL-9菌株对炭疽菌的抑制主要是通过胞外分泌物作用的结果。采用硫酸铵沉淀法获得DSL-9的粗蛋白提取液,蛋白提取液在30~60℃抑菌率无明显变化,大于60℃抑菌率下降;在pH 7~10区间抑菌活性较高,且无明显变化;紫外线对抑菌物质无明显影响;蛋白提取液经蛋白酶处理后,抑菌活性下降。研究内生菌DSL-9对感染炭疽菌砀山梨防御酶活性的影响,发现内生菌DSL-9可提高砀山梨果实对病菌的抗性。从砀山梨中分离筛选的枯草芽孢杆菌DSL-9对砀山梨炭疽病害的生物防治具有潜在的应用价值。

毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白对烟草抗病性的诱导

为明确毁灭炭疽菌Colletotrichum destructivum诱抗蛋白诱导烟草的抗病性及其作用,采用喷雾、摩擦接种方法及RT-PCR技术研究了诱抗蛋白的预防保护作用,以及烟草悬浮细胞经诱导后过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性及脯氨酸(Pro)含量和病程相关基因表达的变化。结果表明,接种3、5和7 d后,该诱抗蛋白对烟草炭疽病的诱抗效果分别为58.00%、48.99%和49.65%,对烟草白粉病的诱抗效果分别为83.26%、80.76%和78.60%,并可以抑制烟草普通花叶病毒的复制及在寄主体内的扩增;经诱抗蛋白处理后,烟草悬浮细胞POD、PPO、PAL活性及Pro含量明显提高;诱抗蛋白能够诱导烟草病程相关蛋白基因PR-1a、PR-1b以及抗病信号传导途径关键基因NPR1的表达。表明毁灭炭疽菌诱抗蛋白可诱导烟草产生抗病性,可能与烟草悬浮细胞中POD、PAL、PPO的活性及Pro的含量提高以及相关病程基因表达有关。