硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ的高效融合表达及其酶学性质研究

目的:本研究旨在实现硫酸软骨素裂解酶ABCⅡ(chondroitinase ABCⅡ,ChSase ABCⅡ)的高效可溶性表达并研究其酶学性质,为ChSase ABCⅡ在药品和保健食品生产中的应用奠定基础。方法:在优化ChSase ABCⅡ基因原始序列的基础上,构建重组质粒pET-28a-His-ChSase ABCⅡ并优化其表达条件;利用亲和层析得到带有多聚组氨酸标签(polyhistidine-tag,His-tag)的ChSase ABCⅡ融合蛋白后,研究了His-ChSase ABCⅡ的部分酶学性质。结果:构建的His-ChSase ABCⅡ融合蛋白表达系统能在大肠杆菌中实现可溶性表达;在表达宿主为E.coli BL21(DE3)和诱导剂(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)浓度为125μmol/L的优化条件下,发酵液酶活力可达到7206.83±184.27 IU/L;纯化后的His-ChSase ABCⅡ酶比活力为22.02±0.39 IU/mg蛋白,最适pH和温度分别为7.5和40℃,其在30~40℃条件下较为稳定,且半衰期在2 h以上。His-ChSase ABCⅡ能特异性有效分解硫酸软骨素,其K_(m)值为10.4±0.8μmol/L,Kcat值为9.4±0.2 s^(-1)。结论:本论文通过基因优化和融合表达等策略实现了His-ChSase ABCⅡ的高效表达和纯化。此外,His-ChSase ABCⅡ的酶学性质可基本满足其在医药和营养产品工业生产中的应用需求。