CRISPR/Cas9结合loxP-Cre技术制备肝特异性G6PC基因缺陷小鼠的实验研究

目的建立肝特异性G6PC基因纯合缺陷的Ia型糖原累积症(glycogen storage disease Ia,GSD Ia)小鼠模型。方法通过CRISPR/Cas9基因重组技术使C57BL/6J小鼠受精卵中G6PC基因外显子2两侧分别插入1个loxP原件,产仔后经鉴定打靶成功的小鼠通过扩繁、兄妹交配及与Alb-Cre小鼠交配,最终产生G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表达的肝特异性G6PC基因2号外显子纯合敲除的GSD Ia小鼠模型。通过监测模型鼠及背景鼠的餐后0~12 h的血糖来验证模型是否成功。结果经PCR鉴定F0及F1代小鼠成功于G6PC基因2号外显子两侧插入loxP原件并可稳定遗传;最终成功建立G6PC-loxP^+/+、Alb-Cre共表达的GSD Ia小鼠,检测餐后1~12 h血糖均低于背景鼠,说明造模成功。结论应用CRISPR/Cas9基因重组技术及loxP-Cre系统可建立肝特异性G6PC基因缺陷的GSD Ia小鼠,可用于该病的病理研究及药物研发。

基于Loxp-Cre系统的去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠模型的构建

目的应用Loxp-Cre系统构建去泛素化酶Otud4基因敲除小鼠。方法利用Loxp-Cre系统原理,将Otud4基因中的4号外显子选为打靶序列,将两个Lox P位点分别设在E4的两端,经打靶载体转入ES细胞、阳性克隆筛选、囊胚注射等过程,得到嵌合体小鼠,再将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配繁育,最终得到杂合子小鼠并进行自交得到新生F1代小鼠。然后利用PCR进行基因型鉴定,使用免疫印迹(WB)技术从蛋白水平检测OTUD4在各组织器官中的表达,以明确基因敲除小鼠是否构建成功。对各基因型小鼠进行数量统计分析明确其是否符合孟德尔遗传定律,是否具有胚胎致死表型。解剖小鼠观察主要组织器官有无明显发育异常,利用HE染色观察是否具有自发的病理改变。通过葡萄糖耐受实验分析基因敲除小鼠是否具有代谢异常等。结果基因型鉴定和WB检测结果显示Otud4基因敲除小鼠模型成功建立。杂合子小鼠自交后各基因型比例符合孟德尔定律,提示Otud4基因敲除小鼠非胚胎致死。各组织器官大小无显著性差异,HE染色并无异常,且Otud4基因敲除后不影响小鼠的血糖稳态。结论应用Loxp-Cre系统成功构建了Otud4基因敲除小鼠,且小鼠正常出生,无任何胚胎发育缺陷,各器官无显著病理性变化,血糖代谢无异常。

肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠模型的构建

目的运用Cre-loxP技术构建肝细胞特异性沉默信息调节因子3(silence information regulator 3,Sirt3)基因敲除(Sirt3^(Δhep))小鼠,为研究肝细胞Sirt3基因在疾病中的生物学功能提供重要动物模型。方法将loxP标记的Sirt3 ^(flox/flox)小鼠与Alb-Cre纯合子(Alb-Cre^(+/+))小鼠进行交配,F1代Sirt3^(flox/-)/Alb-Cre^(+/-)小鼠再与Sirt3^(flox/flox)小鼠进行交配并鉴定,F2代基因型为Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(+/-)的小鼠即为本实验所构建的Sirt3^(Δhep)小鼠,Sirt3 ^(flox/flox)/Alb-Cre^(-/-)小鼠即为对照小鼠Sirt3 ^(flox/flox)小鼠。提取鼠尾DNA,通过PCR鉴定子代小鼠的基因型;免疫荧光双染观察Sirt3在小鼠肝细胞中的表达;提取Sirt3^(Δhep)小鼠原代肝细胞及心脏、脾脏、肾脏、肺组织蛋白,Western blot法验证Sirt3在小鼠肝细胞及其他组织中的表达水平;HE染色观察小鼠肝脏及心脏、脾脏、肺等组织结构。结果成功鉴定出Sirt3^(Δhep)小鼠;免疫荧光及Western blot结果显示,小鼠肝细胞中Sirt3蛋白表达水平低于对照组小鼠(P<0.01),而Sirt3^(Δhep)小鼠的心脏、脾脏、肾脏和肺组织中Sirt3表达与对照组相比无明显变化(P>0.05);HE染色结果显示Sirt3^(Δhep)小鼠肝脏、心脏、脾脏、肺、肾脏的组织学特征与对照组小鼠相比无明显变化。结论成功构建肝细胞特异性Sirt3基因敲除小鼠,为进一步研究肝细胞Sirt3基因在相关疾病中的调控作用机制奠定了基础。

应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。

巨噬细胞特异性敲除KLF2基因小鼠模型构建与鉴定

目的 建立巨噬细胞特异性敲除Kruppel样因子2(kruppel-like factor 2,KLF2)基因小鼠模型,探讨KLF2对巨噬细胞炎症反应的调控作用。方法 运用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KLF2~(flox/+)小鼠。通过与Lyz2-Cre~(+/+)小鼠繁育得到目的基因型小鼠,通过基因型鉴定、实时荧光定量-聚合酶链反应(qRT-PCR)、Western Blot从DNA、RNA、蛋白水平验证KLF2敲除效率。分离培养小鼠骨髓源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages, BMDMs),检测脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症相关因子mRNA变化。结果 建立了KLF2~(flox/flox)/Lyz2-Cre~+基因型小鼠,即巨噬细胞特异性敲除KLF2基因。小鼠骨髓、BMDMs的KLF2 mRNA及蛋白水平显著低于对照组小鼠,而心脏、肝、肾组织中KLF2 mRNA表达较对照组小鼠无显著变化。两组小鼠的体重、进食、进水、形态无显著性差异。在LPS作用下,缺失KLF2的BMDMs炎症相关基因IL-6 mRNA表达水平较对照组显著下降,而IL-1、iNOS、CD86 mRNA表达水平较对照组显著升高。结论 本研究成功构建了巨噬细胞特异性敲除KLF2小鼠模型,为进一步研究巨噬细胞KLF2对临床炎症相关疾病的调控作用及机制奠定基础。

巨噬细胞特异性TDO2基因敲除小鼠的构建

目的构建巨噬细胞特异性色氨酸2,3-双加氧酶(TDO2)基因敲除小鼠,为研究TDO2调控巨噬细胞功能影响疾病发生发展提供动物模型。方法基于Cre-Loxp系统构建巨噬细胞特异性TDO2基因敲除(TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+))小鼠。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型;采用Western blot和免疫荧光验证小鼠巨噬细胞中TDO2敲除效果;通过苏木精-伊红(HE)染色,观察主要组织器官是否存在自发病变。结果基因型鉴定结果表明,flox扩增产物长度在407 bp或408 bp处仅有一条条带且Cre扩增产物长度在543 bp处有一条条带的小鼠即为TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠。Western blot结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDMs)中TDO2表达降低(P<0.01)。免疫荧光结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠腹腔巨噬细胞和BMDMs中TDO2表达降低。HE染色结果显示,与TDO2^(flox/flox)小鼠相比,TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠肝脏、脑、肾脏和脾脏组织内细胞形态无明显差异。结论成功构建TDO2^(flox/flox)Lyz2-iCre^(+)小鼠,为后续深入研究TDO2调控巨噬细胞活化在疾病中的作用和机制提供更加精准的实验动物模型。

肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠模型的制备及鉴定

目的利用Cre-loxP基因敲除技术建立肝星状细胞特异性G蛋白偶联受体激酶2(G protein-coupled receptor kinase 2,GRK2)基因敲除小鼠模型,为研究GRK2在肝星状细胞中的生物学功能提供动物模型基础。方法将loxP标记的Grk2基因小鼠(Grk2^(fl/fl))和Lrat-Cre工具鼠进行多次繁殖,建立肝星状细胞特异性Grk2基因敲除(Grk2^(ΔHSC))小鼠模型。观察和分析小鼠的生长繁殖情况;通过PCR反应鉴定flox和Cre基因型;免疫荧光双染检测肝星状细胞中GRK2表达;Western blot检测小鼠肝星状细胞及肺、脾、肾脏、心脏组织中GRK2蛋白表达;HE染色观察肝脏及肺、脾、心脏、肾脏组织学形态。结果成功鉴定Grk2^(ΔHSC)小鼠基因型;两组小鼠体质量、繁殖能力无明显差异;免疫荧光双染及Western blot结果表明,Grk2^(ΔHSC)小鼠的肝星状细胞中GRK2蛋白水平明显低于对照组小鼠,Grk2^(ΔHSC)小鼠肺、脾、肾脏和心脏组织中GRK2蛋白表达与对照组相比无明显变化;HE染色结果显示,Grk2^(ΔHSC)小鼠肝脏及主要组织结构与Grk2^(fl/fl)相比差异无显著性,可用于后续研究。结论本研究应用Cre-loxP技术成功构建了肝星状细胞特异性Grk2基因敲除小鼠,为进一步研究GRK2在肝脏中的作用提供了优良工具。

Lyz2+单核-巨噬细胞在多囊卵巢综合征小鼠子宫中的谱系示踪

目的在骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠上建立多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)模型,通过谱系示踪方法揭示巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中的分布特点。方法利用Cre/LoxP系统构建骨髓来源巨噬细胞谱系示踪小鼠,分别构建Td-tomato^(flox/flox)小鼠和Lyz2^(Cre)工具小鼠,使两者进行交配,得到Lyz2^(Cre)Tdtomato^(flox/flox)小鼠,其骨髓来源单核-巨噬细胞均被标记上红色荧光蛋白(Td-tomato),再通过来曲唑联合高脂饲料构建PCOS小鼠模型,通过免疫荧光多标结合激光共聚焦共定位方法检测PCOS小鼠子宫中巨噬细胞的分布及数量。结果成功构建了骨髓来源单核-巨噬细胞谱系示踪小鼠(Lyz2^(Cre)Td-tomato^(flox/flox)),并在谱系示踪小鼠上成功构建了PCOS小鼠模型。PCOS小鼠子宫的HE染色结果显示结构异常;免疫荧光多重标记检测发现,在PCOS小鼠子宫中巨噬细胞分布在子宫外膜、肌层、内膜,且M2型巨噬细胞数量增多(P<0.05)。结论本研究构建了肥胖型PCOS小鼠模型,发现骨髓来源的M2型巨噬细胞在PCOS小鼠子宫中增多。

基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法的Ddx3x肝脏条件性敲除小鼠模型的构建与鉴定

目的采用CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法构建DEAD-box RNA解旋酶3X连锁(DEAD-box RNA helicase 3X-linked,Ddx3x)肝脏条件性敲除小鼠。方法设计特异的sgRNA序列,在Ddx3x基因外显子4~10两端插入LoxP序列,构建Ddx3x-flox小鼠。采用PCR方法对F0代和F1代小鼠进行基因鉴定。将Ddx3x-flox F1代小鼠与特异性表达Alb-Cre的工具鼠交配,获得肝脏条件性敲除Ddx3x基因小鼠(Ddx3x^(Δhep))。采用PCR方法和Western blotting方法分别检测Ddx3x^(Δhep)基因小鼠目的基因与蛋白的表达。选取8周龄雄性野生型C57/6J小鼠、Ddx3x^(Δhep)小鼠、Ddx3x^(fl/fl)小鼠,测定血清ALT、AST水平评价肝脏肝损伤情况。结果对F1代小鼠基因PCR鉴定的结果表明,基因型符合Ddx3x^(fl/fl);F1代小鼠与Alb-Cre小鼠杂交,子代与Ddx3x^(fl/fl)小鼠杂交,即获得Ddx3x^(Δhep)小鼠;PCR与Western blotting结果显示,目的小鼠肝组织中Ddx3x基因和蛋白表达显著降低。此外,Ddx3x^(Δhep)小鼠无胚胎致死现象,出生后生理状况良好。正常饲养条件下,Ddx3x^(Δhep)小鼠与Ddx3x^(fl/fl)小鼠及野生型小鼠相比,血清ALT、AST指标及体质量差异均无统计学意义(P>0.05)。结论基于CRISPR/Cas9联合Cre-LoxP方法成功构建了Ddx3x^(Δhep)小鼠动物模型,为后续研究Ddx3x在肝脏中的生物学功能及作用机制奠定了良好的基础。

采用Cre-loxP技术构建肝脏特异性Trappc11基因敲除小鼠模型

目的采用Cre-loxP系统构建肝脏组织特异性Trappc11基因敲除小鼠(Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-))模型以探究脂肪肝的发病机制。方法用带有loxP位点的Trappc11纯合子小鼠(Trappc11^(flox/flox))和带有Alb-Cre的转基因小鼠(Alb-Cre^(+/-))进行杂交,对其子代进行基因型鉴定。筛选出Trappc11^(flox/+)-Alb-Cre^(+/-)小鼠,将其与Trappc11^(flox/flox)小鼠进一步杂交可获得Trappc11肝脏特异性敲除鼠。将3~4周龄的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)、Trappc11^(flox/+)-Alb-^(Cre+/-)和Trappc11^(flox/flox)-Alb-^(Cre-/-)小鼠各3只,提取各组织脏器中的DNA,检测Trappc11的敲除效率和特异性。然后,在mRNA和蛋白质水平进一步验证。于第4周开始监测摄食量和体重等指标。结果我们成功繁育出肝脏特异性Trappc11基因敲除鼠,敲除心、脾、肺、肾、胰腺、肌肉、脂肪和脑组织中该基因表达未受影响,mRNA水平敲除效率达85%以上且TRAPPC11蛋白水平下降。该敲除鼠目前生长状态良好,饮食饮水正常,可用于后期繁殖与机制研究。结论已经构建成功的Trappc11^(flox/flox)-Alb-Cre^(+/-)鼠将为探索Trappc11在肝脏中的生理病理作用提供在体模型。

结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠的构建及初步表型分析

目的:基于CRISPR/Cas9技术构建Retnlb基因的floxp敲入小鼠Retnlbflox/+,进一步根据Cre-LoxP重组酶系统,构建肠道上皮Retnlb基因敲除小鼠(Retnlb-CKO),为后续探究Retnlb基因在炎性肠病中的发病机制提供动物模型。方法:选取8周龄基因型均为Retnlbflox/+的雌、雄C57BL/6N小鼠合笼杂交,筛选出基因型为Retnlb^(flox/flox)的小鼠,将该基因型的小鼠与肠道上皮细胞特异性表达Cre重组酶(Vil1-Cre)工具鼠进行杂交繁育,筛选获得基因型为Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠;再将Retnlb^(flox/+,Cre+)小鼠与Retnlb^(flox/flox)小鼠杂交获得Retnlb^(flox/flox),Cre+目的小鼠(Retnlb-CKO)。选取8周龄Retnlb^(flox/flox),Cre+小鼠与同窝Retnlb^(flox/flox)小鼠各6只进行后续实验。采用RT-qPCR和免疫组化分别检测结肠上皮Retnlb mRNA和蛋白水平。观察每组小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力等表型,计算其各组织重量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况。检测小鼠的肠道屏障完整性和结肠免疫炎症因子的表达情况。结果:通过基因鉴定、mRNA及蛋白水平证实肠道上皮细胞特异性条件敲除小鼠构建成功。与对照组小鼠相比,Retnlb-CKO小鼠的身长、体重、饮食和生殖能力均未发生明显的变化,心、肝、脾、肺、肾和结肠的重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。检测Retnlb-CKO小鼠结肠组织的紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin3的mRNA表达显著降低(P<0.01),PAS染色和免疫组化结果分别显示Retnlb-CKO小鼠结肠组织的杯状细胞数量和溶菌酶阳性细胞数量均显著减少(P<0.01)。HE染色观察Retnlb-CKO小鼠的结肠组织显示没有明显的炎症细胞浸润,RT-qPCR进一步显示结肠组织的促炎因子NLRP3、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和肿瘤坏死因子α(TNF-α)表达显著下调(P<0.01),同时,炎症信号通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB表达也显著下调(P<0.01)。结论:成功构建并验证了条件性结肠细胞Retnlb基因敲除小鼠模型。结肠细胞缺失Retnlb会导致肠道屏障受损,结肠组织促炎因子mRNA表达显著降低,炎症通路蛋白TLR4、MyD88和NF-κB的mRNA表达显著下调。

基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测

目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。

条件性基因敲除诱导剂他莫昔芬对小鼠肠道微生物群组成的影响

他莫昔芬(Tamoxifen)作为一种选择性雌激素受体调节剂,在临床上应用于治疗乳腺癌,在生物遗传学领域研究中充当诱导型Cre-loxP条件性基因敲除系统的时空开关。肠道微生物与宿主基因紧密相连,与宿主肠道吸收、代谢、发育性疾病、肿瘤密切相关,利用他莫昔芬诱导特定基因敲除已成为探究微生物与宿主基因互作的主要研究方式。已有研究表明他莫昔芬引发雌激素受体介导的毒性,干扰宿主生物学功能,少有研究报道他莫昔芬本身是否对小鼠肠道微生物群的稳定性造成影响,本研究通过给野生型C57BL/6J小鼠注射他莫昔芬模拟条件性基因敲除以研究其影响及机制。研究结果发现,注射他莫昔芬组与对照组相比,小鼠体重、肠道组织结构与形态及肠道屏障功能无明显差异,但他莫昔芬对小鼠粪便和盲肠内容物中的微生物丰度产生影响。这些结果提示使用他莫昔芬诱导小鼠条件性基因敲除时需要注意肠道菌群改变带来的生理和病理表型,从而减少他莫昔芬带来的干扰。

基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠

背景:前期在体外成功构建了SENP1基因沉默的人肺泡上皮细胞系,在细胞水平上研究了SENP1在高氧性肺损伤中的作用。目的:基于Cre-loxP重组酶系统构建肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠模型。方法:将SENP1^(flox/-)小鼠自交得到SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/-)小鼠;将Sftpc-Cre^(+/+)小鼠与野生型小鼠交配获得更多的Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。将Sftpc-Cre^(+/+)或子代Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/-)或子代SENP1^(flox/flox)小鼠进行杂交,获得SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)双杂合小鼠。将SENP1^(flox/-)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠与SENP1^(flox/flox)小鼠杂交,获得SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。剪鼠尾提取基因组DNA,行PCR扩增,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳确定小鼠基因型。取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织行免疫荧光双标实验及Western blot以验证SENP1敲除效果;取SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠心、肝、肺、肾组织行苏木精-伊红染色以观察两组小鼠各脏器的组织形态。结果与结论:琼脂糖凝胶电泳正确筛选出SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠。免疫荧光双标实验显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1的平均荧光强度降低(P<0.01),且SENP1和Sftpc未见明显共定位(P<0.01)。Western blot结果显示,与SENP1^(flox/flox)小鼠相比,SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠肺组织中SENP1蛋白表达降低(P<0.001)。苏木精-伊红染色结果显示SENP1^(flox/flox)和SENP1^(flox/flox)Sftpc-Cre^(+/-)小鼠的心、肝、肺和肾脏组织形态无明显改变。该研究利用Cre-loxP重组酶系统成功构建了肺泡Ⅱ型上皮细胞特异性敲除SENP1基因小鼠,为后续研究SENP1基因在以肺泡Ⅱ型上皮细胞为主要损伤细胞的肺疾病如支气管肺发育不良、特发性肺纤维化中的作用提供了良好的工具。

T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠的繁育及鉴定

目的繁育T细胞条件性敲除Spi1基因的小鼠并对其进行鉴定,为进一步探索Spi1编码蛋白PU.1的作用提供研究基础。方法将Lck-Cre小鼠与Spi1^(flox/flox)小鼠进行杂交繁育,通过聚合酶链式反应(PCR)和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,筛选出基因型为Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)的小鼠即为T细胞条件性敲除Spi1基因的纯合子小鼠。使用磁珠分选脾脏T淋巴细胞,并应用Western blot、实时荧光定量PCR(qPCR)及流式细胞术检测PU.1在T细胞中的敲除效率。结果Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠基因稳定遗传。与Spi1^(flox/flox)小鼠相比,Lck-Cre×Spi1^(flox/flox)小鼠脾脏T细胞中的PU.1表达水平显著降低。结论该研究应用Cre/LoxP系统和CRISPR/Cas9技术成功构建了T细胞条件性敲除Spi1基因小鼠,为后续研究PU.1在T细胞相关疾病中的具体作用提供了可靠的动物模型。

Trappc11诱导型基因敲除小鼠模型的构建及鉴定

目的建立转运蛋白颗粒复合物亚基11(Trappc11)诱导型基因敲除小鼠模型。方法和结果在Trappc11基因外显子3~5的两侧分别引入loxP位点,利用CRISPR/Cas9技术获得F0代C57BL/6J小鼠;将通过PCR扩增及测序鉴定阳性的F0代C57BL/6J小鼠与C57BL/6J野生型小鼠交配、繁殖,获得F1代Trappc11flox/+小鼠;再将Trappc11flox/+小鼠与UBC-CreERT2小鼠交配,经过2代繁殖,最终获得Trappc11诱导型全身性基因敲除小鼠模型。结论通过CRISPR/Cas9和Cre-loxP技术成功建立了Trappc11诱导型基因敲除小鼠模型,为揭示Trappc11在多器官系统疾病中的病理生理学作用提供了重要工具。

蛋白激酶D3血管内皮细胞条件性敲除小鼠的构建及表型分析

目的构建Prkd3血管内皮细胞条件性敲除小鼠并分析其表型,探讨血管内皮细胞上Prkd3条件性敲除小鼠的敲除效率及可能的表型。方法利用Cre/LoxP系统构建血管内皮细胞条件性基因敲除小鼠模型,即分别构建Prkd3flox/flox小鼠和Cdh5-Cre工具小鼠,再将两者进行交配,筛选得到Prkd3血管内皮条件性敲除小鼠(Cdh5-Cre;Prkd3flox/flox,简称Prkd3ΔEC)。在血管内皮细胞内特异性敲除Prkd3,通过鼠尾PCR法进行基因型鉴定;分离肝血窦内皮细胞并用Western blot检测敲除效率,通过功能学及组织病理学方法评估内皮细胞中Prkd3缺失对肝脏的影响。结果成功构建Prkd3ΔEC,敲除效率大于90%。表型分析发现,Prkd3ΔEC小鼠表现出自发性肝纤维化,随年龄增长逐渐加重(P<0.05);通过HE染色和天狼星红染色发现肝脏中胶原纤维增多,血管周围的纤维成分明显增多(P<0.05)。表明血管内皮细胞中Prkd3缺失能够诱发自发性肝纤维化。结论成功构建了Prkd3ΔEC,该条件性敲除小鼠的肝脏存在自发性肝纤维化情况。

巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠的构建及鉴定

目的构建并鉴定巨噬细胞条件性高尔基体蛋白73(golgi protein 73,GP73)基因敲除小鼠,为进一步研究GP73调控巨噬细胞功能影响肿瘤性疾病的发生发展提供动物模型。方法基于Cre/LoxP重组系统构建GP73^(flox/+)小鼠,通过GP73^(flox/+)小鼠雌雄自交得到GP73flox/flox小鼠。将GP73flox/flox小鼠与Lyz2⁃Cre+小鼠杂交,得到GP73flox/+Lyz2⁃Cre+小鼠,再将其与GP73flox/flox小鼠杂交,最终得到基因型为GP73flox/floxLyz2⁃Cre+的巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠(MKO小鼠);以GP73flox/floxLyz2⁃Cre-小鼠作为对照组小鼠(GP73^(fl/fl)小鼠)。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠flox及Cre基因型。采用实时荧光定量PCR(qPCR)及蛋白免疫印迹(Western blot)分别从mRNA水平和蛋白水平验证小鼠巨噬细胞GP73敲除效果及组织特异性。计算小鼠各组织质量与体重的比值以分析小鼠的生长发育情况,并检测小鼠血生化指标。结果通过基因鉴定、mRNA水平及蛋白水平证实巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠构建成功。qPCR检测显示,与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠骨髓来源巨噬细胞(bone marrow⁃derived macrophages,BMDMs)和腹腔原位巨噬细胞(peritoneal macrophages,PM)中GP73 mRNA水平均降低(P<0.0001);Western blot检测结果显示,GP73蛋白在MKO小鼠BMDMs和PM中的表达水平均较GP73^(fl/fl)小鼠明显降低,但在肝脏、肾脏及胸腺组织中GP73蛋白表达水平无显著差异。与GP73^(fl/fl)小鼠相比,MKO小鼠心、肝、脾、肺、肾、棕色脂肪及白色脂肪组织重量与体重之比无差异,各组织无形态学差异。血生化检测结果显示,MKO小鼠与GP73^(fl/fl)小鼠的各项血生化指标差异均无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建巨噬细胞条件性GP73基因敲除小鼠模型,为深入研究GP73调控巨噬细胞功能在肿瘤性疾病中的作用和机制提供良好的动物模型。

CRISPR/Cas9系统介导的猪MRC1修饰基因降低PCV2复制的研究

旨在获得MRC1基因修饰的PCV2靶细胞并在体外验证该细胞对PCV2的抑制作用,为后续基因编辑猪的生产提供理论基础。本研究:1)首先利用基因工程技术建立了慢病毒介导的高效同源重组载体和CRISPR/Cas9基因靶向系统;2)通过细胞和分子生物学技术筛选了定点整合表达MRC1的PK15细胞系;3)随后通过细胞试验和PCV2的攻毒试验对其抗PCV2的作用进行了相关验证。结果:1)成功构建了含有红色荧光标记基因、嘌呤霉素标记基因、同向LoxP序列和多克隆位点的pLV-LoxP-mCherry-puro-LoxP载体,同时根据不同猪品种间MRC1基因启动子差异序列设计同源臂,成功构建同源重组载体和靶向同源臂的CRISPR/Cas9基因靶向载体;2)通过病毒包装和共转染的方法,利用嘌呤霉素筛选并验证了MRC1启动子基因编辑的PK15细胞株,成功将MRC1基因转录起始位点上游多出的14 bp敲入到PK15细胞中;3)随后对基因编辑的PK15细胞系进行抗病毒验证,MRC1基因编辑的PK15细胞株MRC1的蛋白表达量显著增高(P<0.05),同时显著降低了PCV2的复制(P<0.05)。MRC1启动子编辑的PK15细胞中MRC1蛋白表达量显著增高,该位点可以用于抗PCV2猪的制备。

胰岛β细胞Metrnl基因敲除小鼠的鉴定及初步表型分析

目的:基于Cre-LoxP重组酶系统,构建胰岛β细胞Metrnl基因敲除小鼠(Metrnl-KO),为进一步探究Metrnl基因在糖尿病疾病中的发病机制提供动物模型。方法:将雌雄基因型均为Metrnlfloxp/+的小鼠合笼杂交,筛选出基因型为Metrnl^(floxp/floxp)的小鼠,将该基因型小鼠与胰岛β细胞特异性表达Cre重组酶(Ins-2)工具鼠进行杂交繁育,获得基因型为Metrnl^(floxp/+;Cre+)的小鼠;再将Metrnl^(floxp/+;Cre+)小鼠与Metrnl^(floxp/floxp)小鼠杂交获得Metrnl^(floxp/floxp;Cre+)小鼠,基因型为Metrnl^(floxp/floxp;Cre+)的小鼠即为目的鼠。采用RT-q PCR检测Metrnl和胰岛素(Ins-1和Ins-2)的m RNA水平;免疫组化和免疫荧光染色观察胰岛组织Metrnl和胰岛素的蛋白表达情况;记录小鼠体重,同时测定小鼠糖耐量和胰岛素耐量。结果:RT-q PCR和免疫组化结果均显示Metrnl-KO小鼠胰岛组织中Metrnl的m RNA和蛋白水平显著低于对照鼠(P<0.01);Metrnl-KO小鼠与对照鼠相比,体重无明显变化,但糖耐量受损且对胰岛素敏感性降低(P<0.05);RTq PCR结果显示胰岛组织中Ins-1和Ins-2的m RNA水平显著下调(P<0.01),且免疫荧光结果提示胰岛组织中胰岛素表达低于对照鼠(P<0.05);葡萄糖刺激的胰岛素分泌实验结果显示,Metrnl敲除可引起小鼠胰岛素分泌减少(P<0.05)。结论:我们构建并验证了条件性胰岛β细胞Metrnl基因敲除小鼠模型,还发现Metrnl的特异性敲除影响了小鼠的糖耐量和胰岛素耐受性,同时Metrnl敲除引起小鼠胰岛素分泌能力受损,为进一步研究Metrnl在糖尿病发生发展中的具体机制提供了研究基础。