应用Cre-LoxP系统构建牛结节性皮肤病病毒缺失TK基因毒株

利用同源重组技术及Cre-LoxP系统平台,构建牛结节性皮肤病病毒(lumpy skin disease virus,LSDV)缺失TK基因毒株,为研制出安全、高效的LSDV基因工程疫苗提供备选毒株。以TK基因为靶基因,利用Cre-LoxP系统平台,红色荧光蛋白(RFP)为筛选标记,采用重叠PCR方法扩增左、右同源臂以及RFP基因表达框并进行融合,将其克隆至pUC19T载体,构建基因缺失转移载体pUC19T-LSDV-ΔTK-RFP。将转移载体重组质粒转染至Vero细胞,并感染LSDV/CHA/FJ/2021毒株,构建LSDV-ΔTK-RFP重组病毒。采取蚀斑法、有限稀释法纯化LSDV-ΔTK-RFP。然后,利用Cre-LoxP系统,在MDBK-Cre细胞中从病毒基因组中切除RFP标签,采取蚀斑法和有限稀释法筛选并纯化LSDV-ΔTK毒株。利用PCR及测序方法对重组毒株进行鉴定,并测定其一步生长曲线。结果表明成功构建缺失TK基因的重组毒株(LSDV-ΔTK),重组毒株复制力略低于野生毒株。应用Cre-LoxP系统构建的缺失TK基因LSDV毒株,具有良好的遗传稳定性和复制生长特性,为后续LSDV基因工程疫苗的研制提供了候选毒株,同时拓展了Cre-LoxP系统的应用范围。

基于Cre/Loxp系统的Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠的构建及效率检测

目的构建报告基因小鼠,评价Csf1r-Cre^(ERT2)介导增强黄色荧光素蛋白EYFP标记组织CD45^(+)细胞CSF1R的效率。方法Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠繁育,他莫昔芬诱导、PCR筛选Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)小鼠,流式细胞术和Western blot分析EYFP对不同组织以及不同组织CD45^(+)细胞中CSF1R的标记效率。结果获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)报告基因小鼠。此外,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP可有效标记小鼠组织CSF1R以及不同部位中CD45^(+)细胞。与R26R^(EYFP)组比较,Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠介导EYFP标记效率最高的是脑组织(P<0.001),最低的是胸腺组织(P<0.05),脾脏组织则差异无统计学意义。结论成年Csf1r-Cre^(ERT2)小鼠与R26R^(EYFP)小鼠是获得Csf1r-Cre^(ERT2)R26R^(EYFP)诱导型条件性荧光小鼠的有效途径。Csf1r-Cre^(ERT2)介导EYFP可对小鼠不同部位CSF1R以及CD45^(+)细胞中CSF1R进行有效示踪。

基于Cre/loxP系统的糖皮质激素受体基因条件性打靶嵌合鼠的获得

目的:应用Cre/loxP系统建立诱导型糖皮质激素受体(GR)基因剔除小鼠模型,为在体内直接进行GR基因的研究提供条件。方法:针对GR基因第2外显子构建诱导型目标载体,将打靶载体电穿孔转染胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES),经Southern杂交筛选发生正确同源重组的ES细胞,囊胚注射法制备嵌合体并进行生殖系检测及纯化建系。结果:成功构建了针对GR基因第2外显子的诱导型目标载体,转染ES细胞获得了工程化的ES细胞,经囊胚注射获得了由工程化的ES细胞和体细胞共同发育而来的嵌合体小鼠。结论:基于Cre/loxP系统的GR基因条件性打靶嵌合鼠的获得,为得到理想的诱导型GR基因剔除小鼠模型奠定了基础。

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

应用Cre/loxp系统构建含有BAC序列的重组伪狂犬病毒

近年来我国出现伪狂犬病毒变异株,导致猪伪狂犬病重新爆发流行。为研究伪狂犬病毒变异株毒力增强与抗原变异的分子机制,需要建立该病毒的感染性克隆操作系统。本研究通过构建转移载体pTEGGF,利用同源重组将含有增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)表达框及两翼各一个loxp位点,插入到伪狂犬病毒变异株PRV JS-2012 gG编码区下游,获得重组病毒rJS2012-gG/EGFP。将表达Cre重组酶的质粒pcDNA3.1-Cre转染BHK-21细胞,再感染rJS2012-gG/EGFP,筛选获得含有单一loxp位点的重组病毒rJS2012-gG/loxp。将rJS2012-gG/loxp基因组、含有EGFP标记基因的BAC载体p Belo BAC11-EGFP和pcDNA3.1-cre共转染BHK-21,获得含有BAC序列插入的重组病毒rJS2012-BAC。一步生长曲线与空斑试验显示,重组病毒rJS2012-BAC在体外生长略慢于亲本病毒。本研究成功构建了含有BAC载体的重组伪狂犬病毒,为进一步建立伪狂犬病毒变异株的感染性克隆操作系统,开展变异株的分子病原学研究打下良好基础。

利用Cre/loxP系统和rd29A启动子构建诱导型植物标记基因删除载体

出于对转基因作物中标记基因的安全性考虑,植物转基因育种中标记基因的删除将成为未来研究的热点之一。位点特异性重组系统之一Cre/loxP系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。为了利用Cre/loxP系统构建一种可调控的标记基因删除系统,本研究首先从拟南芥中克隆了逆境诱导型的启动子rd29A,同时从质粒pCre上克隆了Cre基因,构建了含有rd29A:Cre:Tnos表达元件的中间载体,将这一表达元件插入到另一植物双元表达载体pKsb中,最终构建了含有loxP-Pnos-nptⅡ-Tocs-rd29A-Cre-Tnos-loxP的可诱导型删除标记基因nptⅡ的植物双元表达载体。

Cre/Loxp系统的应用及进展

随着分子生物学的迅猛发展，转基因技术发挥着越来越重要的作用，已经渗透到人类生活的各个领域。所谓转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达从而引起生物体性状可遗传的修饰。转基因技术推动了从分子水平了解生命现象、探讨生命本质、研究疾病发生机理等方面的发展。国内外在动物转基因技术方面均已开展了卓有成效的工作。其中小鼠转基因研究方面成就最大、发展最为迅速、应用最为广泛的就是应用Cre／Loxp系统对小鼠进行基因的敲除、激活、倒转和易位等。

利用信息肽诱导和Cre/LoxP系统构建猪链球菌基因缺失株

为建立一种高效的猪链球菌(Streptococcus suis)基因缺失方法,本研究利用信息肽诱导DNA片段转化和Cre/LoxP系统去除抗性基因这两种技术,通过在S.suis 05ZYH33的ssu05_1921基因上、下游片段和壮观霉素抗性基因(spc)片段之间引入LoxP位点,采用信息肽GE9诱导构建的DNA片段转化S.suis并发生重组,经抗性筛选快速获得spc替代ssu05_1921基因的缺失株;进一步引入pSET6s/P_(tufA-cre)质粒表达Cre重组酶作用于LoxP位点,去除spc基因,产生无痕ssu05_1921基因缺失株,经测序和RT-PCR验证缺失正确。本研究建立的该方法简单、快捷、阳性率高,为构建S.suis基因缺失株、研究S.suis致病机制提供了新的选择。

利用Cre/loxP系统删除转Bt基因水稻中的选择标记基因

来源于噬菌体P1的Cre/loxP位点特异性重组系统是目前在植物遗传转化中应用较多,较成熟的一个标记基因删除系统。在这个系统中,Cre酶可以特异性的识别和切割位于两个lox位点之间的标记基因,整个系统重组仅需Cre和lox识别位点即可完成而无需其它辅因子的参加。利用农杆菌介导法成功地将cre基因导入供试材料"皖粳97",得到转hpt-cre基因水稻植株;将其与先期转基因育成的携带loxp-hpt-loxp-bt基因的"皖粳97"株系进行田间杂交,通过PCR分析,Cre/loxP重组系统定向删除了潮霉素抗性筛选标记基因。

Cre/LoxP系统在转基因小鼠上的应用策略

Cre/LoxP位点特异重组酶系统已发展为在体内外进行遗传操作的一个新的有力工具 .该系统在转基因小鼠上的应用 ,可使转基因的表达或靶基因的缺失 /突变的位点特异DNA重组不仅发生在小鼠发育的某一阶段或特定的组织器官 ,而且 ,若与控制Cre表达或功能的诱导系统结合 ,则可以时空方式体现 .

应用Cre/loxP系统在转化细胞水平上高效删除转基因水稻的标记基因

研究了Cre/loxP系统在转化细胞水平上删除转基因水稻中抗性标记基因的可行性和效率。采用农杆菌介导法将Cre/loxP标记基因剪切系统载体pNCG导入水稻细胞,用G418筛选法获得水稻抗性愈伤组织后,在组织培养不同阶段的培养基中添加25μmol/L雌激素进行Cre基因的诱导表达和标记基因的剪切,PCR检测T0植株中标记基因nptⅡ、重组酶基因Cre和目标基因gusA的整合情况。将扩增结果为gusA(+)/nptⅡ(-)/Cre(-)的转基因植株统计为标记基因剪切成功的植株。结果表明,在抗性愈伤组织培养的预分化前、预分化和分化阶段添加雌激素诱导表达重组酶Cre均能成功切除标记基因序列,标记基因剪切成功率为6.82%～46.43%。在预分化前采用液体培养基添加雌激素诱导处理愈伤组织3d,T0植株中标记基因的剪切效率高达173.33%,主要原因是雌激素处理提高了愈伤组织绿苗分化率。直接在分化培养基中添加雌激素诱导处理,T0植株中标记基因剪切成功率达46.43%,剪切效率(144.44%)也较高。表明雌激素诱导的Cre/loxP系统能在水稻抗性愈伤组织水平上实现对标记基因序列高效快速删除。

Cre/LoxP系统联合SV40 LTag诱导可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系的建立

目的探索可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞的建立方法。方法采用胰酶消化法分离培养大鼠皮肤成纤维细胞;逆转录病毒载体(SSR69)转染成纤维细胞,筛选稳定表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞;用表达Cre重组酶的腺病毒感染永生化成纤维细胞,筛选获得回复后成纤维细胞。对原代、永生化及回复后成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长状态;采用细胞生长曲线法测定细胞增殖能力。免疫荧光染色检测Vimentin在原代及永生化成纤维细胞中的表达情况,平板克隆实验评价回复后成纤维细胞的致瘤性。结果提取了大鼠皮肤成纤维细胞,并筛选出表达SV40 LTag的永生化成纤维细胞,二者形态无明显差异,均贴壁生长,呈长梭形或多角形,但永生化成纤维细胞体外增殖能力明显高于原代成纤维细胞(P<0.05),在体外培养传代>25代。细胞免疫荧光提示两种细胞均在细胞质内表达Vimentin。回复后成纤维细胞不表达SV40 LTag,其体外增殖能力与原代细胞无明显差异(P>0.05),无致瘤性。结论应用Cre/LoxP系统联合SV40 LTag可以建立可复性永生化大鼠皮肤成纤维细胞系。

基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系

【目的】通过构建能够在植物生长发育阶段经乙醇诱导将选择标记基因删除的载体,消除选择标记基因带来的潜在安全隐患。【方法】利用AlcR/alcA诱导系统和Cre/loxP位点特异性重组系统删除选择标记基因。当外源诱导物乙醇存在时,激活下游Cre的表达。Cre重组酶识别2个同向loxP位点,剔除位点之间的DNA片段,包括选择标记基因、AlcR/alcA系统和Cre/loxP系统,而目的基因gus在诱导前后均为组成型表达。【结果】拟南芥转基因植株受乙醇诱导严格控制Cre表达的"开"和"关"。经诱导的转基因植株不能在选择培养基上继续生长。分子生物学检测显示,2个同向loxP位点间序列均已删除,表明标记基因删除效果明显。【结论】基于AlcR/alcA和Cre/loxP系统的标记基因诱导删除体系切实可行,有广泛的应用前景。

利用Cre/loxP系统构建胰岛α细胞特异性敲除血管紧张素转换酶2基因的小鼠模型

目的构建α细胞特异性血管紧张素转换酶2(ACE2)敲除小鼠模型,为研究胰岛α细胞ACE2功能提供基础。方法利用Cre/loxP系统,将雌性ACE2 loxP/WT与雄性Gcg-cre+/-小鼠进行交配,取鼠尾组织,通过PCR法鉴定子代基因型。选取基因型为ACE2loxP/y Gcg-cre+/-的雄性小鼠为实验所需要构建的模型小鼠(αACE2KO小鼠)。采用免疫荧光和免疫组织化学法检测ACE2表达。采用独立样本t检验。结果免疫荧光分析提示,在Gcg-Cre小鼠胰岛中,(55.14±25.33)%的α细胞表达ACE2,然而αACE2KO小鼠胰岛α细胞中未检测到ACE2表达(t=14.202,P<0.01),同时αACE2KO小鼠的肝、肾、肺、心和骨骼肌中仍然表达ACE2。结论成功利用Cre/loxP原理特异性敲除α细胞ACE2,为研究胰岛局部α细胞ACE2功能提供动物模型和基础。

基于Cre/LoxP系统的Smad2条件基因打靶小鼠的建立

Ｓｍａｄｓ家族是转化生长因子ＴＧＦ－β信号转导途径中一个重要的新基因家族．ＳＭＡＤ２属于受体激活的ＳＭＡＤｓ．Ｓｍａｄ２基因在多种肿瘤中发生突变，是一种可能的肿瘤抑制基因．Ｓｍａｄ２基因完全剔除导致小鼠在胚胎期６、５ ｄ死亡．为了研究Ｓｍａｄ２在脊椎动物成体各组织器官及肿瘤发生中的可能作用，利用Ｃｒｅ／ＬｏｘＰ系统构建了Ｓｍａｄ２条件基因打靶载体，将两个方向相同的ＬｏｘＰ序列置于编码ＳＭＡＤ２蛋白Ｃ末端功能域序列两侧的内含子中，并在组成型表达Ｃｒｅ重组酶的大肠杆菌中检测了ＬｏｘＰ位点的功能；用打靶载体电击转染小鼠胚胎干细胞，经Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交筛选到３株发生正确同源重组的中靶ＥＳ细胞克隆；通过囊胚显微注射将中靶ＥＳ细胞导入受体小鼠囊胚腔，获得了ＥＳ细胞种系嵌合体；对高嵌合度小鼠与Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ的子代小鼠进行基因型鉴定，成功地获得了Ｓｍａｄ２条件基因打靶小鼠．

Cre/loxP位点特异性重组系统在植物中应用的研究进展

Cre/loxP位点特异性重组系统自发现以来,在植物基因重组领域得到了广泛应用,已成为提高转基因植物安全性的有效方法。本文介绍了该系统的基本概况及其在转基因植物表达载体构建方面的应用,尤其是在基因删除、定点整合、多基因表达以及杂种优势利用等方面的应用做了重点阐述。

Cre/Loxp和四环素系统在基因可控表达中的应用

本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/Loxp系统解决多个基因定向表达问题的设想。

Cre/loxP位点特异性重组系统及其在口腔医学领域中的应用

Cre/loxP位点特异性重组系统由Cre重组酶和loxP位点组成。Cre重组酶可识别loxP位点并催化2个loxP位点之间的DNA进行精确的位点特异性重组。该系统作用方式简单、重组效率高,可定时、定位地对基因进行修饰,已成为一种定向改变生物活体遗传信息的重要的试验工具。本文主要就Cre/loxP系统的结构、重组机制、特点及其在口腔医学领域中的应用作一综述。

SV40TAg和Cre／loxP系统诱导的正常人可逆性转化黑素细胞在豚鼠体内的存活能力和复色实验

目的研究sv40TAg基因和Cre／loxP系统在体外诱导正常人黑素细胞的可逆性转化以及转化细胞在豚鼠体内的存活能力和复色效果。方法用Cre—ERn病毒上清感染经SV40TAg基因转化的正常人黑素细胞（MCT），诱导Cre重组酶表达（MCTC）；过氧化氢法建立黄褐色雄性豚鼠白癜风动物模型，按黑素细胞移植方法进行原代黑素细胞和MCTC移植，观察MCTC在豚鼠体内的存活能力及复色效果。结果MCTC细胞移植实验结果显示，1个月左右移植区即可见色素沉着，连续观察3个月，可见0．5～1cm的黑色斑片或褐色斑片形成。移植成功率为82．5％，原代黑素细胞移植成功率为76．7％。病理观察移植12￡有明显黑素沉积，部分毛囊内也可见黑素沉积。结论联合应用SV40TAg基因和Cre／loxP系统可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞，具有与原代黑素细胞相似的在体存活率，具备在体黑素合成功能，可以达到良好的复色效果。

利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗株

通过对4株伪狂犬病病毒(PRV)流行株进行比较,选择免疫原性最高的HNQYY2012为亲本株,利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统构建带有LoxP位点的HNQYY2012ΔgE/EGFP^+,然后利用环化重组酶(Cre)去除增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE。PCR鉴定和测序结果表明,PRV gE基因缺失株构建成功;一步生长曲线表明,HNQYY2012ΔgE增殖速度慢于亲本株,但最高滴度与亲本株相近;HNQYY2012ΔgE和亲本株对小鼠的半数致死量分别为10^3.8TCID50和10^2.5TCID50,表明gE基因缺失株毒力降低。制备的灭活疫苗免疫小鼠能完全抵御5LD50和10LD50强毒攻毒。本文利用CRISPR-Cas9技术和Cre/loxP系统成功构建PRV gE基因缺失株HNQYY2012ΔgE,为猪伪狂犬病灭活疫苗的研制提供了参考。