前体物质对Glarea lozoyensis发酵产生纽莫康定B_0的影响（英文）

纽莫康定B_0是棘白菌素类化合物,其半合成衍生物卡泊芬净已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于治疗无效或无法耐受其他抗真菌药的患者的侵袭性曲霉病。然而,通过发酵产生的纽莫康定B_0的效价较低,限制了卡泊芬净的工业生产。本研究将优化好的的培养基进行了改良,添加了4种前体物质。研究结果表明,大豆油、亮氨酸、异丁醇和甲硫氨酸显著影响发酵单位;进一步的正交试验结果表明,大豆油(A)对纽莫康定B_0效价的影响极显著(P<0.05),亮氨酸(B)、异丁醇(C)和甲硫氨酸(D)影响次之,最优发酵条件为A2B2C3D2即大豆油6.0g/L,亮氨酸1.0g/L,异丁醇4.0ml/L,甲硫氨酸0.3g/L时,纽莫康定B_0发酵单位达到1295mg/L左右。此外,还应用正交试验验证各因素的显着性。当将kLa作为指导参数,使用A315型叶轮的100L发酵罐进行放大和工业规模生产时,与原始效价相比,纽莫康定B_0产量增加了361%,并达到了2250mg/m L的水平。

不同冷冻保藏条件对Glarea lozoyensis生长及产纽莫康定B_0能力的影响

棘白菌素类化合物纽莫康定B_0生产菌株Glarea lozoyensis,在其连续传代和发酵过程中都观察到菌株的变异,给科研、生产带来极大困扰。因此,采用低温冷冻保藏对G.lozoyensis Q1进行长期保存。采用单因素实验法研究了低温保护剂类型、保藏温度以及低温保护剂浓度对G.lozoyensis Q1菌体形态和发酵性能的影响。以作用于全细胞的80 g/L甘油和作用于细胞壁外的200 g/L PEG-6000作为低温保护剂,在-80℃保藏3个月后,纽莫康定B_0产量达到1.6 g/L,与保藏前基本一致。并且,当菌体保藏过后菌丝形态能维持一定褶皱的实验组产量均能保持在1 g/L以上,当表面趋于光滑时产量急剧下降,仅为初始的25%左右。结果表明,以甘油及PEG-6000作为冷冻保护剂,在-80℃条件下可实现G.lozoyensis Q1长期保藏。

原生质体诱变筛选高产纽莫康定B_0的菌株

目的对产纽莫康定B_0的丝状真菌(Glarea lozoyensis)ATCC 74030进行原生质体制备、再生及常压室温等离子体诱变育种进行研究,选育高产纽莫康定B_0的菌株。方法采用单因素实验法研究了原生质体形成和再生的最佳条件,并将原生质体通过常压室温等离子体诱变。结果 Glarea lozoyensis原生质体形成和再生的最佳条件为:菌体培养9d,0.6mol/L的葡萄糖溶液作为渗透压稳定剂,采用2%Yatalase+3%溶壁酶+1%蜗牛酶组成的复合酶系,34℃条件下酶解3.5h。经过常压室温等离子体诱变,筛选出的原生质体诱变菌株G.lozoyensis Q1,其产量达1.13g/L,相对出发菌株产量(0.81g/L)提高了39.5%,且连续传代5代遗传稳定。结论常压室温等离子体诱变提高ATCC 74030发酵单位效果明显,实验结果表明突变株G.lozoyensis Q1具有潜在的生产应用价值。

HPLC法同时测定发酵液中纽莫康定A_0与B_0的含量

采用HPLC方法同时测定发酵液中纽莫康定A0与B0的含量。色谱柱为SepaxSapphire C18(4.6 mm×250mm,5μm),流动相为甲醇-水(体积比45∶55,内含0.1‰三氟乙酸),流速为1.0 mL.min-1,紫外检测波长为214nm。结果表明,纽莫康定A0与B0的浓度分别在47.5～191.4μg.mL-1和38.4～153.6μg.mL-1的范围内,与峰面积呈良好的线性关系(R分别为0.9997和0.9998);检测灵敏度分别为6.86 ng、5.95 ng;平均回收率分别为99.15%(RSD=0.96%,n=9)和99.31%(RSD=0.98%,n=9)。该方法简便、准确、重现性好,可用于发酵液中纽莫康定A0与B0含量的测定。

一种纽莫康定B_(0)丝氨酸类似物的分离和结构鉴定

目的从Zalerion arboricola菌体发酵液制备的纽莫康定B_(0)粗品中,分离纯化纽莫康定B_(0)丝氨酸类似物,并鉴定其化学结构。方法首先用PSN色谱填料进行富集;随后用X_(3)和C_(18)色谱填料进行分离、纯化,得到样品后用质谱、核磁进行检测,并对检测数据进行汇总、分析,鉴定该目标化合物的化学结构。结果经过分离、纯化得到目标化合物样品,进行结构鉴定后确定该化合物为纽莫康定B_(0)丝氨酸类似物,与文献报道的结构一致。结论分离、纯化得到的纽莫康定B_(0)丝氨酸类似物,为进行发酵及纯化工艺优化、质量研究,以及进行结构修饰,筛选活性物质奠定了基础。

基于渗透压调控的纽莫康定B_0发酵动力学

以海洋丝状真菌Glarea lozoyensis Q45为研究对象,研究不同渗透压条件下Glarea lozoyensis Q45的生长、底物甘露醇消耗以及纽莫康定B_0的生产特性。基于Logistics方程、Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret-Like方程,得到了描述纽莫康定B_0发酵模型的动力学参数。基于发酵动力学模型,提出了在菌体生长稳定期添加1.61 g/L Na Cl的调控策略。在该策略下,纽莫康定B_0的产量达到1.75 g/L,比初始条件的结果提高24.6%。

一种检测纽莫康定B_(0)和C_(0)质量浓度的HPLC方法研究

建立了一种高效液相色谱(HPLC)方法同时测定纽莫康定B_(0)和纽莫康定C_(0)的质量浓度,采用Waters XBridge Amide色谱柱,检测波长220 nm,以V(纯水)∶V(乙腈)为流动相,梯度洗脱。检测结果表明:纽莫康定B_(0)和C_(0)的质量浓度在定量限至400 mg/L范围内线性关系良好,定量限在0.1 mg/L左右,检测限在0.03 mg/L左右,纽莫康定B_(0)和C_(0)的平均回收率分别为99.2%和98.9%,重复性试验纽莫康定B_(0)和C_(0)质量浓度的RSD分别为0.39%和0.42%,纽莫康定B_(0)对照品溶液、纽莫康定C_(0)对照品溶液和供试品溶液在室温条件下24 h内稳定。

高压制备纽莫康定B_(0)的中试研究

为制得高纯度的纽莫康定B_(0),以给下游合成卡泊芬净提供物料,用单因素实验的方法,对流动相比例、上样量和洗脱流速等高压制备条件进行了优化,并对产品质量和制备液稳定性进行了分析,最终确定了V(二氯甲烷(工业))∶V(甲醇)∶V(水)=42∶9∶1,上样量为11.4 g粗品,洗脱流速为480 mL/min。制备液保存温度为4℃,需7 d内处理完毕。通过该方法,可以得到质量分数95%以上的B_(0),并能有效将B_(0)异构体C_(0)降至0.05%以下,为卡泊芬净的合成研究提供了质量保证。

纽莫康定杂质C_(0)的制备研究

目的 为控制纽莫康定B_(0)的质量及为卡泊芬净的杂质传递研究提供物料,本研究对关键杂质纽莫康定C_(0)进行了制备。方法 通过发酵液提取工艺富集、高压液相制备色谱、减压浓缩、冷冻干燥,制备得到纽莫康定C_(0)干粉,并对其进行紫外吸收光谱、红外吸收光谱、核磁共振、质谱等分析和结构鉴定。结果 得到了色谱纯度99.19%、峰纯度999.4(DAD检测器)、热重3.05%的纽莫康定C_(0)干粉1.7395 g,其结构经过确证为纽莫康定C_(0)。结论 制备得到的纽莫康定C_(0),可作为质量研究对照品和杂质传递研究用物料,并对纽莫康定其他杂质的制备具有重要参考价值。

丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108产纽莫康定B_0发酵条件的研究

【目的】采用响应面法优化丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108发酵生产纽莫康定B_0培养基,提高发酵产量;通过氮源优化,降低发酵液菌体浓度,改善发酵过程的溶氧水平。【方法】采用Plackett-Burman设计和响应面法进行培养基优化,筛选出对纽莫康定B_0产量具有显著影响的因素;通过最陡爬坡实验及Box-Behnken设计,并利用Design-Expert软件对实验数据进行回归分析,得到优化的发酵培养基配方;通过对优化培养基中氮源组分进行全因子实验,最终得到高产量和低菌体浓度发酵培养基。【结果】实验数据表明:甘露醇、脯氨酸和葡萄糖对纽莫康定B_0产量影响最大;最佳浓度分别为甘露醇167.3 g/L、脯氨酸26.1 g/L、葡萄糖28.5 g/L。采用优化后的培养基进行摇瓶发酵,纽莫康定B_0产量达到了1 840 mg/L,较优化前提高了42%,与预测结果一致。用硫酸铵部分替换棉籽饼粉后,发酵液菌体浓度降低,在100 L发酵罐上对优化后的结果做了进一步的验证,纽莫康定B_0产量达到1 980 mg/L。【结论】模型预测值与实验值有较高吻合度,具备较高可信度和显著性,发酵产量提高了42%,响应面实验设计和分析方法能够有效地用于丝状真菌Glarea lozoyensis SIIA-F1108产纽莫康定B_0发酵培养基进行优化。通过调整培养基中的氮源组成,降低了发酵液菌体浓度,改善了发酵过程的溶氧水平。

产纽莫康定B_(0)丝状真菌Filamentous fungus的菌种选育和发酵工艺优化

纽莫康定B0(pneumocandin B0,PB0)是由丝状真菌Filamentous fungus产生的次级代谢产物,可用于合成抗真菌药物卡泊芬净。为提高PB0的产量,对丝状真菌SIPI 2776菌株进行亚硝基胍(NTG)、60Co伽马射线(60Co-γ)、紫外(UV)和常压室温等离子体(ARTP)等诱变,获得突变菌株11-γ-12,PB0摇瓶产量为1.48 g/L。此外,利用基因工程改造技术得到纽莫康定C0(PC0)含量降低的工程菌株F-ap-htyE。使用响应面法优化发酵培养基,使PB0摇瓶产量达到2.01 g/L,并研究了发酵罐的分批补料培养,通过优化甘露醇的补加量,使PB0发酵产量达到2.71 g/L。

一种控制纽莫康定B_(0)清洁残留的高效液相色谱法

建立了HPLC法测定纽莫康定B_(0)(1)残留。色谱柱采用Waters XBridge®Amide柱(4.6 mm×250 mm,3.5μm),流动相为0.1%磷酸水溶液∶乙腈(13∶87),等度洗脱,检测波长为195 nm,柱温为40℃,流速为0.6 ml/min,进样量为20μl。结果显示,1在0.0150~1.2614μg/ml内线性关系良好,r=0.9995。检测限为0.092 ng,定量限为0.3 ng。棉签回收率(n=6)、方法回收率(n=9)、316L型不锈钢擦拭取样回收率(n=6)、316L型不锈钢淋洗取样回收率(n=6)分别为98.0%、99.3%、88.6%和98.1%,RSD分别为0.79%、1.26%、2.30%和1.33%。本法准确、简便、重复性好,可用于测定设备清洁后1的残留。

丝状真菌SIIA-F1108产生抗真菌物质的分离纯化和结构鉴定

目的研究丝状真菌SIIA-F1108发酵液中抗真菌的活性成分。方法利用大孔吸附树脂吸附、正相硅胶色谱层析和高压液相制备等技术,结合白念珠菌抑菌实验进行跟踪检测,分离丝状真菌SIIA-F1108的发酵液中的活性组分;通过紫外光谱、红外光谱、高分辨质谱、核磁共振进行分析,确定活性组分的结构。结果分离纯化得到SIIA-C1108A和SIIA-C1108B活性组分,分子式均为C_(50)H_(80)N_8O_(17),与文献报道的纽莫康定(pneumocandin)B_0和C_0同质。结论从丝状真菌SIIA-F1108的发酵液中分离得到的两个具有抗真菌活性物质分别为纽莫康定B_0和C_0,其中纽莫康定B_0作为合成醋酸卡泊芬净的前体物质,具备重要的经济价值。

一种 Zalerion arboricola 发酵产物的分离、纯化和结构鉴定

抗真菌药物卡泊芬净是以丝状真菌Zalerion arboricola的菌体代谢产物纽莫康定B 0为中间体经化学合成得到。该菌在代谢产纽莫康定B 0的同时还会产生多种具有相似结构的代谢物。为了从这些结构类似物中寻找潜在的抗真菌药物中间体,对Zalerion arboricola菌株HCCB30111的代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定。本实验成功的从该菌株的发酵液中分离到一个化合物,经结构鉴定证明其为纽莫康定B 0的结构类似物。该发现为进一步质量研究,结构修饰和抗真菌活性物质的筛选工作奠定了基础。