SPLUNC1基因在人体组织中的表达分布特征

目的探讨人SPLUNC1基因在人体组织中的表达分布特征。方法采用原位杂交方法检测人体37种组织中SPLUNC1基因的细胞学定位。结果原位杂交结果显示:SPLUNC1在上腭、表皮、食管及食管-贲门部的鳞状上皮,鼻咽部、气管、宫颈部化生的鳞状上皮及食管和肺的鳞状细胞癌中均不表达;在胃粘膜、胆囊、空肠、结肠、子宫内膜及腺体和宫颈部的单层柱状上皮细胞中也不表达;主要表达在鼻咽、气管和支气管的假复层纤毛柱状上皮中,且沿呼吸道从上至下,该基因表达逐渐减弱,在肺组织中检测不到其表达。在腮腺、下颌下腺的导管和浆液腺细胞、鼻咽和肺等部位的粘膜下浆液腺细胞、胃粘膜固有层壁细胞及乳腺小叶和导管上皮中表达SPLUNC1,但粘液性腺上皮细胞中不表达。此外,在肺、胃、结肠、乳腺、子宫内膜和宫颈等部位的腺癌组织中,SPLUNC1基因均呈强阳性表达。结论 SPLUNC1基因的表达具有明显的细胞特异性,其表达分布特征可能与细胞功能有关。

重组SPLUNC1抑菌及调节NE活性的研究

为研究重组绵羊短腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白(rSPLUNC1)的抑菌活性及对中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)活性的调节作用,本实验采用微量稀释法测定rSPLUNC1对巴氏杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌生长的抑制作用;采用显色底物检测法测定rSPLUNC1对NE活性的调节作用。抑菌检测结果表明10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL rSPLUNC1能够极显著地抑制巴氏杆菌、大肠杆菌的生长(p<0.01),并且呈剂量效应;显色底物检测结果表明10μg/mL和20μg/mL^40μg/mL rSPLUNC1可以显著和极显著地提高绵羊肺炎支原体(Mo)感染的外周中性粒细胞NE的活性(p<0.05,p<0.01)。表明rSPLUNC1能够抑制革兰氏阴性菌的生长并提高NE活性,可能有助于机体抵御呼吸道的感染。

重组SPLUNC1蛋白对感染绵羊肺炎支原体的盘羊杂交羊的免疫调节作用研究

为研究重组SPLUNC1蛋白对感染绵羊肺炎支原体(MO)后的盘羊杂交羊免疫调节作用,本研究将6只巴什拜羊分为A组,18只盘羊杂交羊随机分为B、C、D组,对实验羊人工感染MO后第5 d,C组气管注射巴什拜羊重组SPLUNC1蛋白、D组气管注射盘羊杂交羊重组SPLUNC1蛋白,每天150μg/只;A、B组每天气管注射等量的生理盐水作为对照组。采用ELISA方法检测各组羊血清中MO抗体水平以及IL-8、IL-12、IL-13表达水平。结果显示,感染前所有实验羊MO抗体均为阴性,感染后第14 d所有实验羊MO抗体均为阳性;IL-8水平在感染后第14 d^21 d,A、C、D组极显著和显著地低于B组(p<0.01;p<0.05;p<0.01)。IL-12水平在感染后第14 d,A、C和D组极显著和显著地低于B组(p<0.01;p<0.05;p<0.01),第21 d时,A、C和D组极显著低于B组(p<0.01)。IL-13水平在感染后第5 d,A组显著低于B、C和D组(p<0.05),在第7 d^21 d,A、C、D组显著和极显著低于B组(p<0.05;p<0.01;p<0.01)。实验数据表明重组SPLUNC1蛋白对盘羊杂交羊具有明显的免疫调节作用。本研究为绵羊支原体肺炎的治疗提供了实验依据。

RACE法克隆湖羊SPLUNC1基因及序列分析

通过克隆湖羊短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)基因的cDNA序列,为研究其蛋白的结构和功能奠定基础。参照GenBank上牛、山羊的SPLUNC1基因的cDNA序列,设计简并引物,分别扩增出5′和3′端目的片段,测序后进行拼接,获得湖羊SPLUNC1基因cDNA全长序列,并对序列进行分析。结果表明:克隆的湖羊SPLUNC1基因cDNA序列全长为1 091bp(GenBank登录号KJ749828),其中开放阅读框为768bp,共编码255个氨基酸。构建的氨基酸进化树结果显示湖羊SPLUNC1与预测绵羊的氨基酸同源性最高,山羊次之。

脂多糖诱导SPLUNC1基因的表达

目的了解脂多糖(LPS)对人支气管上皮细胞(HBECs)增殖的影响,通过观察不同浓度脂多糖(LPS)不同时间诱导HBECs的短上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)基因表达情况,探讨SPLUNC1在呼吸道感染中的作用。方法采用0.01、0.1、1.0、10 mg/L LPS诱导HBECs,通过噻唑蓝(MMT)法检测LPS对HBECs增殖的影响,诱导HBECs 2、4、8、16、24 h后通过实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测SPLUNC1基因表达情况,结果以SPLUNC1/GAPDH基因拷贝数比值表示。结果 0.01、0.1、1.0、10 mg/L的LPS均可抑制HBECs的生长[吸光度(A值):0.48±0.03、0.37±0.01、0.30±0.03、0.27±0.02,相对生长指数:94.12%、72.55%、58.82%、52.94%],并能诱导SPLUNC1基因表达上调;在同一浓度组,LPS刺激细胞2 h后SPLUNC1基因表达开始上调,随着时间延长逐渐升高,呈时间依赖性[0.01 mg/L组2、4、8、16、24 h分别为0.19±0.03、0.24±0.04、0.26±0.03、0.44±0.05、0.51±0.07;0.1 mg/L组分别为0.43±0.02、0.52±0.05、0.60±0.06、0.63±0.08、0.68±0.05;1.0 mg/L组分别为0.44±0.02、0.48±0.02、0.50±0.03、0.58±0.05、0.70±0.06;10 mg/L组分别为0.34±0.03、0.38±0.04、0.68±0.05、0.96±0.08、0.98±0.07],不同时间点组间比较差异有统计学意义(均P<0.01)。结论 LPS可抑制HBECs的生长,能诱导HBEC细胞SPLUNC1基因表达上调,并在一定浓度范围内表达呈时间依赖性,推测SPLUNC1可能参与细菌感染最初的防御。

LPS对A549和Hela细胞SPLUNC1蛋白表达的影响

目的探讨脂多糖(LPS)对人肺腺癌上皮A549细胞和人子宫颈癌上皮Hela细胞短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate,lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)蛋白表达的影响。方法将两类细胞各随机分为对照组、实验组,CCK-8法观察LPS与细胞增殖活性的时间-反应和剂量-反应关系,筛选各自的最佳效应浓度和作用时间,以LPS最佳效应浓度和作用时间处理后,免疫组化和免疫荧光定量法检测两类细胞SPLUNC1蛋白相对表达量的变化。结果 LPS对A549细胞的最佳效应浓度为20 mg/L,最佳效应时间为12 h,对Hela细胞的最佳效应浓度为40 mg/L,12~24 h为其最佳效应时间窗。SPLUNC1在两类细胞中均呈阳性表达,LPS处理后表达均显著上调(P <0. 05),两类细胞间比较,LPS处理后Hela细胞SPLUNC1相对表达量高于A549细胞(P <0. 05),较对照的增量值(Δ)也明显大于A549细胞(P <0. 05)。结论 SPLUNC1在宫颈癌细胞中存在表达,可能是肺腺癌和宫颈癌病变中的保护性因子,具有潜在的临床应用价值。

LPLUNC1基因对鼻咽癌细胞HNE1生长增殖的抑制作用研究

LPLUNC1在正常的鼻咽组织及人胚鼻咽组织中高表达,而在71%的鼻咽癌中表达下调或缺失,是与鼻咽癌的发生发展密切相关的新基因.通过研究LPLUNC1基因对鼻咽癌细胞系HNE1的影响,进一步确定其与鼻咽癌发生发展的关系.将LPLUNC1基因全长cDNA克隆入pcDNA3.1(+)真核表达载体中,通过脂质体介导稳定转染入LPLUNC1低表达鼻咽癌细胞系HNE1中,通过RT-PCR及RNA印迹筛选LPLUNC1高表达的细胞株,并利用细胞生长曲线、MTT、BrdU掺入、流式细胞仪检测、软琼脂集落形成实验及裸鼠成瘤等实验,研究了LPLUNC1对鼻咽癌细胞系HNE1细胞生长、增殖的影响.结果发现,稳定转染LPLUNC1的HNE1细胞的生长速度明显减慢,在MTT与BrdU掺入实验发现LPLUNC1可明显地抑制鼻咽癌细胞的增殖,并且通过流式细胞仪检测也发现,LPLUNC1基因可明显延缓HNE1细胞的细胞周期进程,使G0/G1期细胞增多而S期细胞相对减少.进一步通过软琼脂集落形成及裸鼠成瘤实验发现,LPLUNC1稳定转染后的HNE1细胞集落形成率与集落的大小均小于空白载体细胞,同时能明显地抑制HNE1细胞的体外成瘤.结果表明,LPLUNC1基因能明显抑制鼻咽癌细胞HNE1的生长增殖,是鼻咽癌发生发展中的重要候选抑瘤基因之一.

复发性鼻息肉患者PLUNC、TLR2和HO-1蛋白表达及意义

目的探讨复发性鼻息肉患者腭、肺及鼻咽上皮克隆(PLUNC)蛋白、Toll样受体2(TLR-2)蛋白和血红素加氧酶-1(HO-1)蛋白表达及意义。方法选取2016年1月至2017年10月在我院治疗的鼻息肉患者75例,其中初发性鼻息肉患者40例(初发组)、复发性鼻息肉患者35例(复发组),同时选取40例正常中鼻甲黏膜者作为对照组,采用免疫组织化学法检测PLUNC、TLR2和HO-1蛋白表达情况。结果复发组PLUNC蛋白阳性表达率为17.14%,明显低于初发组和对照组(P<0.05);初发组PLUNC蛋白阳性表达率为45.00%,明显低于对照组(P<0.05);复发组TLR-2和HO-1蛋白阳性表达率为91.43%和85.71%,明显高于初发组和对照组(P<0.05);初发组TLR-2和HO-1蛋白阳性表达率为52.50%和55.00%,明显高于对照组(P<0.05);PLUNC与TLR2、HO-1蛋白表达呈负相关(rs=-0.622和-0.534,P<0.05),TLR2和HO-1蛋白表达呈正相关(rs=0.466,P<0.05)。结论鼻息肉患者PLUNC蛋白表达下调,而TLR2和HO-1蛋白表达上调,3种蛋白的表达与鼻息肉复发有一定的相关性,且三者之间存在相关关系。

姜黄素对子宫颈癌Hela细胞凋亡及SPLUNC1蛋白表达的影响

目的探讨姜黄素对子宫颈癌Hela细胞凋亡及对短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1(short palate lung and nasal epithelium clone 1,SPLUNC1)表达的影响。方法取对数生长期Hela细胞,分别设置对照组(姜黄素0μmol/L)、实验A组(姜黄素4μmol/L)、实验B组(姜黄素8μmol/L)、实验C组(姜黄素16μmol/L)、实验D组(姜黄素32μmol/L)、实验E组(姜黄素64μmol/L)、实验F组(姜黄素128μmol/L),采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定姜黄素对子宫颈癌Hela细胞的增殖抑制作用,4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色观察细胞凋亡形态,异硫氢酸荧光素标记的膜联蛋白V/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)双染流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测SPLUNC1蛋白的表达。结果与对照组比较,实验各组细胞增殖抑制率均明显增加(P均<0.05),且除实验F组外,细胞增殖抑制率随姜黄素剂量增加而增加,呈剂量依赖性,差异有统计学意义(P均<0.05);其半数抑制浓度(IC50)=43.32μmol/L。对照组细胞形态正常,实验C、D、E组出现了典型的细胞凋亡形态变化,细胞核碎裂、固缩。与对照组比较,实验C、D、E组凋亡率随姜黄素剂量增加而增加,差异有统计学意义(P均<0.05);与对照组比较,实验C、D、E组SPLUNC1蛋白表达随姜黄素剂量增加而下降。结论在一定浓度范围内,姜黄素可明显促进子宫颈癌Hela细胞凋亡,抑制Hela细胞的增殖,其作用可能与下调SPLUNC1的表达相关。

SPLUNC1-Ig融合蛋白在CHO细胞中的稳定表达及活性初步分析

目的 构建短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（SPLUNC1）-Ig融合蛋白表达体系并初步分析其活性.方法 在质粒PGEM-T easy-SPLUNC1基础上联合应用大引物法和巢式PCR实现目的序列147位碱基的定点突变,亚克隆于表达载体PDH3,构建PDH3-SPLUNC1的表达质粒.稳定转染CHO/dhfr-细胞完成SPLUNC1-Ig融合蛋白的表达,并在氨甲喋呤（MTX）加压下筛选出稳定表达的细胞株,应用ELISA检测蛋白表达的水平.利用蛋白A亲和层析系统纯化获得的SPLUNC1-Ig融合蛋白,并用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹进行鉴定,经ELISA、Western免疫印迹分析SPLUNC1-Ig融合蛋白的特异性和活性.结果 经酶切及测序结果证实预定位点已突变,琼脂糖凝胶电泳出现大小为768 bp的目的条带;测序发现SPLUNC1基因的147位碱基A均已突变成C,证实PDH3-SPLUNC1表达质粒构建成功.RT-PCR扩增出768 bp大小的SPLUNC1基因.ELISA检测CHO/dhfr-细胞上清表明SPLUNC1-Ig融合蛋白在3个月内稳定表达,水平与时间的延长无关.经亲和层析获得SPLUNC1-Ig融合蛋白,SDS-PAGE电泳可见相对分子质量约52 500大小的条带.Western免疫印迹也在45 000与66 200之间出现与预测位置相符的特异目的条带.SPLUNC1-Ig融合蛋白浓度为0.39 mg/L时与脂多糖结合活性明显高于阴性对照,6.25 mg/L时与脂多糖结合的A450值基本达到平台期.Western免疫印迹也显示未变性的脂多糖可与SPLUNC1-Ig融合蛋白结合,而变性后却不能与之结合.结论 建立了非切胶纯化的定点突变方法,顺利实现了表达质粒的构建.成功构建SPLUNC1-Ig融合蛋白表达体系,其分泌的目的蛋白具有蛋白的天然结构和体外活性.

感染绵羊肺炎支原体后绵羊SPLUNC1 mRNA表达水平监测

为检测绵羊感染绵羊肺炎支原体(MO)前后的短腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1(SPLUNC1)表达水平变化,对6只巴什拜羊和6只盘羊杂交羊分别人工感染MO,在感染前(第0天)和感染后第5、14、21天,采集口腔喉咽部的上腭组织,用Real-time PCR方法检测SPLUNC1mRNA的表达水平。结果:感染后两组羊SPLUNC1 mRNA的相对表达水平均升高,在感染后第14~21天,巴什拜羊SPLUNC1 mRNA水平均极显著高于盘羊杂交羊(P<001)。该结果说明在临床上表现为抗MO感染的巴什拜羊,体内可表达高水平的SPLUNC1 mRNA,这为巴什拜羊抗MO感染的机理研究提供一定的参考依据。

肺炎链球菌诱导SPLUNC1表达及白藜芦醇对SPLUNC1表达的影响

目的探讨肺炎链球菌(SP)感染时短腭、肺及鼻咽上皮克隆1(SPLUNC1)的宿主防御作用,及白藜芦醇(Res)对SPLUNC1表达的影响,为SP感染性疾病的治疗提供新的思路。方法根据感染复数(MOI)不同将SP感染BEAS-2B细胞分为对照组、MOI20 SP组和MOI50 SP组;根据Res药物浓度不同将Res预处理MOI20 SP感染BEAS-2B细胞分为12.5Res+SP组、25Res+SP组、50Res+SP组(Res终浓度分别为12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L)。通过CCK-8法检测细胞活性,并选出SP、Res最佳作用浓度及时间。正式实验分为对照组、Res组、SP组和Res+SP组,采用实时定量PCR法和ELISA法检测各组SPLUNC1 m RNA及蛋白表达。结果随SP感染时间延长,细胞活性呈降低趋势;与对照组和MOI20 SP组相比,MOI50 SP组细胞活性有下降趋势;与MOI20 SP组相比,25Res+SP组细胞活性增强(P<0.05),50Res+SP组细胞活性降低(P<0.05)。以MOI20 SP菌悬液和25μmol/L Res进行正式实验。SP组和Res+SP组随感染时间延长,BEAS-2B细胞SPLUNC1m RNA水平表达先增高,后降低(P<0.05);与SP组相比,各时间点Res+SP组SPLUNC1 m RNA及蛋白表达水平均增高(P<0.05);与对照组相比,仅Res组SPLUNC1 m RNA及蛋白表达水平随时间延长未见明显改变(P>0.05)。结论 SP感染可以诱导SPLUNC1表达,发挥宿主防御作用,Res可以在感染发生时上调SPLUNC1的表达,以浓度及时间依赖的方式加强细胞保护。

新型抗菌肽α4-短肽体外对铜绿假单胞菌的抑制作用

目的探讨抗菌肽α4-短肽体外对铜绿假单胞菌生长的抑制作用,为临床治疗以铜绿假单胞菌为主的肺部感染性疾病提供新思路。方法体外观察α4-短肽对铜绿假单胞菌标准株PAO1体外生长曲线和生物膜形成的影响,并分析α4-短肽对PAO1刺激后巨噬细胞(RAW264.7)炎症水平的影响。选取若干株临床耐药菌株,体外观察α4-短肽对其生长曲线的影响。结果α4-短肽可抑制PAO1生长及生物膜的形成,8μmol/L时效果达最佳(P<0.001)。α4-短肽预处理RAW264.7后,由PAO1引起的IL-6和TNF-α的mRNA表达下调,8μmol/L时效果最佳(P<0.001)。分离得到4株铜绿假单胞菌多重耐药菌株和2株肺炎克雷伯菌耐药菌,α4-短肽对其生长均产生较好的抑制作用。结论α4-短肽能较好地抑制铜绿假单胞菌生长及其生物膜形成,降低铜绿假单胞菌导致的炎症水平,并对临床耐药菌株有较好的抑制效果。

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1与耳鼻咽喉科疾病

短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate lung and nasal epithelium clone 1,是近年发现的一个特异性表达在呼吸道的天然免疫分子，其结构与杀菌／渗透性增加蛋白（bactericidal/permeability increasing protein, BPI）相似，且具有明显的疏水性，在免疫防御中发挥着重要的作用，参与对外界刺激的反应，与耳鼻咽喉科多种疾病包括感染、变态反应和肿瘤等相关。本文将对SPLUNC1在耳鼻咽喉科的新进展做一综述。

SPLUNCl在呼吸道感染中的作用及其调节

呼吸道与外界环境相通，长期暴露于各种理化物质及病原微生物刺激之下，其上皮细胞分泌的具有抗菌活性的蛋白对维持机体健康至关重要。短腭、肺及鼻咽上皮克隆1（short palate，lung，and nasal epithelium clone1，SPLUNCl）就是新近发现的一种具有抗菌活性的蛋白，其结构与杀菌／渗透性增加蛋白相似，能特异结合革兰阴性菌细胞壁上的脂多糖，有助于维持内稳态、保持肺内无菌环境，在快速激活先天免疫及启动适应性免疫中起守门员作用，有望作为抗菌制剂用于呼吸道细菌感染性疾病的治疗。