橙皮素通过内质网应激通路诱导人肺癌细胞PC9发生凋亡

目的探讨不同剂量橙皮素对人肺腺癌PC9细胞凋亡和内质网应激的诱导效应及相关通路蛋白水平的变化。方法用不同剂量的橙皮素处理PC9细胞,使用LDH释放试剂盒检测其细胞毒性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blot法检测凋亡通路中Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1、Bcl-2和细胞色素C水平的变化,同时检测内质网应激中相关蛋白CHOP、Caspase-4、Bip、p-JNK以及三大感受器蛋白p-Perk、IRE1和ATF6的水平变化。结果随着橙皮素浓度的增加,其对PC9细胞的杀伤效应逐渐增加;在橙皮素浓度不变时,随着时间的推移,杀伤效应也逐渐增加,橙皮素对PC9细胞的杀伤效应呈时间-剂量依赖。随着橙皮素浓度的增高,PC9细胞的凋亡率逐渐上升,以早期凋亡细胞为主。不同剂量的橙皮素处理PC9细胞后,线粒体途径凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Apaf-1和细胞色素C水平均有不同程度的增高,而Bcl-2水平则有所下降。橙皮素处理PC9细胞还可以诱导内质网应激相关蛋白CHOP、Caspase-4、Bip、p-JNK及感受器蛋白p-Perk、IRE1和c-ATF6表达水平上调。结论橙皮素对PC9细胞具有杀伤效应,同时可以诱导PC9细胞发生线粒体途径凋亡,而这种凋亡诱导效应可能与内质网应激相关。

隐丹参酮联合顺铂作用于非小细胞肺癌PC9细胞的体外研究

目的观察隐丹参酮(CPT)联合顺铂(DDP)对非小细胞肺癌PC9细胞的抗肿瘤作用及其分子机制。方法肺癌PC9细胞分为对照组、隐丹参酮组、顺铂组及联合用药组,MTT法检测细胞增殖凋亡,免疫印迹技术、RT-PCR检测抗凋亡分子的表达、STAT3及上游调控激酶JAK2/SRC蛋白表达水平及磷酸化水平。结果隐丹参酮联合顺铂有明显抑制肺癌PC9细胞增殖作用(P<0.05),联合用药组作用于肺癌PC9细胞24h后,caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达明显增高,高于对照组及单药组;联合用药组Mcl-1、Bcl-2、XIAP、survivin抗凋亡蛋白表达下调(P<0.05或P<0.01),STAT3磷酸化Tyr705和ser727水平下降,其上游JAK2磷酸化水平下调,SRC蛋白及磷酸化水平变化不明显。结论隐丹参酮联合顺铂具有协同抗肺癌PC9细胞作用,其作用机制可能是通过抑制STAT3磷酸化Tyr705和ser727表达水平,进而下调Mcl-1、Bcl-2、XIAP、Survivin蛋白的表达,上调caspase 3和caspase 9及PARP剪切段蛋白表达。

青蒿素衍生物KPC-L006对肺癌PC9细胞的抗肿瘤作用

研究青蒿素衍生物KPC-L006的体外抗肺癌活性。以不同浓度KPC-L006处理正常培养的肺癌PC9细胞。采用MTS方法检测KPC-L006处理后对PC9细胞活力的影响;进行细胞划痕实验评价药物对细胞迁移的抑制作用;AnnexinV/PI实验检测细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹技术检测凋亡相关蛋白水平的变化。KPC-L006处理后,PC9细胞活力明显下降;划痕修复率降低,细胞迁移能力减弱;细胞凋亡率明显升高;促凋亡相关蛋白Caspase-3,Bax水平提高,抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低。KPC-L006具有明显的抗肺癌活性。

白杨素通过促进氧化应激介导的AKT/mTOR通路失活诱导肺癌细胞发生自噬

目的研究白杨素(Chrysin,CHR,5,7-二羟基黄酮)通过AKT/mTOR通路在肺癌细胞中诱导自噬的机制。方法培养肺癌细胞A549及PC9并通过行细胞活力实验、克隆形成实验检测白杨素对肺癌细胞增殖能力的影响;通过行透射电镜、免疫荧光实验、蛋白质印记、活性氧实验等探究AKT/mTOR通路在肺癌细胞中诱导自噬的机制。结果1.细胞增殖实验、克隆形成实验结果表明,白杨素可以以时间浓度依赖性的方式抑制肺癌细胞增殖。2.透射电镜的结果显示,白杨素能够增加肺癌细胞中自噬小体和自噬溶酶体数量。3.免疫荧光的实验结果表明,在白杨素作用后的肺癌细胞中,检测到LC3Ⅱ的细胞内定位和丰富的LC3Ⅱ斑点,而对照组细胞没有表现出明显的荧光强度。4.一定浓度的白杨素上调了肺癌细胞中LC3Ⅱ和Beclin 1蛋白的表达,下调了P62蛋白的表达。联合使用氯喹(CQ)后,LC3Ⅱ的表达进一步升高。5.细胞增殖实验结果表明,在加入氯喹后,白杨素对肺癌细胞增殖的抑制的能力进一步增强。6.白杨素可以促进肺癌细胞活性氧(ROS)集聚,在加入N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)后,LC3Ⅱ的表达下调。7.白杨素抑制了AKT/mTOR通路相关蛋白的表达,在加入NAC后,通路相关蛋白的表达升高。结论在肺癌中,活性氧介导的AKT/mTOR通路的失活参与了白杨素诱导的自噬,自噬抑制剂可以进一步增强白杨素的抗癌效果。

白藜芦醇与吉非替尼的协同抗肺癌作用及机制研究

目的探讨白藜芦醇是否能提高吉非替尼对肺癌细胞的杀伤活性并研究其机制。方法MTT法检测人非小细胞肺癌细胞系PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的细胞活力。Western blot实验检测低浓度吉非替尼和白藜芦醇对PC9细胞c-met表达水平,表皮生长因子受体(EGFR)、磷脂酰肌醇激酶(PI3K)、丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)磷酸化水平及caspases活化水平。流式细胞术检测PC9细胞在低浓度吉非替尼和白藜芦醇处理下的凋亡率。结果低浓度吉非替尼联合白藜芦醇对PC9的细胞活力抑制率显著高于低浓度吉非替尼组和白藜芦醇组[(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(8.6±0.8)%,P<0.05]。白藜芦醇处理可诱导PC9细胞c-met蛋白的下调并显著增强低浓度吉非替尼对PC9细胞PI3K和AKT磷酸化水平的抑制作用。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞活力的抑制率和凋亡诱导率显著高于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组[抑制率:(57.7±3.3)%比(12.4±1.1)%、(16.3±1.3)%,P<0.05;凋亡率:(30.9±1.8)%比(7.2±0.5)%、(10.6±0.8)%,P<0.05]。低浓度吉非替尼联合白藜芦醇组对PC9细胞caspase-9及caspase-3的活化显著强于低浓度吉非替尼组和低浓度吉非替尼+白藜芦醇+c-met质粒组。结论白藜芦醇可能通过下调c-met的表达提高肺癌细胞对吉非替尼的敏感性。

二氢青蒿素对TNF相关凋亡诱导配体抗肺癌细胞活性的影响及其机制研究

目的探讨二氢青蒿素对肿瘤坏死因子(TNF)相关凋亡诱导配体(TRAIL)抗肺癌活性的影响及其机制。方法将PC9人肺癌细胞按对照组、二氢青蒿素组、TRAIL组、二氢青蒿素+TRAIL组及二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组进行分组,MTT法检测二氢青蒿素及TRAIL对PC9细胞的杀伤活性,流式细胞术检测PC9细胞的凋亡和活性氧簇(ROS)的释放,Western blot实验检测PC9细胞c-FLIP表达、细胞色素C释放及Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活化。结果二氢青蒿素能显著抑制PC9细胞中c-FLIP蛋白的表达。二氢青蒿素+TRAIL组PC9细胞的相对细胞活力(0.41±0.04)显著低于TRAIL组[(0.83±0.06),P<0.05]和二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组[(0.75±0.06),P<0.05]。二氢青蒿素+TRAIL组PC9细胞的凋亡率(35.4±2.6)%显著高于TRAIL组[(8.7±0.8)%,P<0.05]和二氢青蒿素+TRAIL+c-FLIP质粒组[(13.5±1.1)%,P<0.05]。二氢青蒿素能显著促进TRAIL诱导的ROS的产生和细胞色素C从线粒体中的释放。二氢青蒿素能显著促进TRAIL诱导的PC9细胞中Caspase-8、Caspase-9和Caspase-3的活化。结论二氢青蒿素通过抑制c-FLIP的表达,增强TRAIL对肺癌细胞的凋亡诱导活性。

益气祛痰解毒方通过调控FRMD6抑制非小细胞肺癌进展的作用机制研究

目的探究益气祛痰解毒方对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞的抑制作用和分子调控机制。方法构建FERM结构域蛋白6(FRMD6)敲低PC9细胞株。实验分为对照组、益气祛痰解毒方组、shNC组、shFRMD6组、益气祛痰解毒方+shNC组、益气祛痰解毒方+shFRMD6组。采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测PC9细胞的FRMD6表达水平变化。应用CCK-8法检测PC9细胞增殖率。采用Annexin V-FITC/PI法检测PC9细胞凋亡情况。利用Transwell实验检测PC9细胞侵袭能力。利用Western blot检测各组FRMD6、c-Met、p-PI3K、PI3K、p-Akt和Akt蛋白的表达。结果CCK-8检测结果表明,与对照组比较,益气祛痰解毒方对PC9细胞增殖具有显著抑制效果[(55.28±2.62)%比(100.00±2.10)%,P<0.05]。qRT-PCR和Western blot结果显示,益气祛痰解毒方可上调FRMD6表达[(1.60±0.11)比(1.00±0.13),P<0.01]。同时,与shNC组比较,益气祛痰解毒方+shNC组显著抑制PC9细胞增殖[(56.25±2.62)%比(100.00±2.10)%,P<0.05]、侵袭并促进细胞凋亡。Western blot结果发现,与shNC组比较,益气祛痰解毒方+shNC组的c-Met、p-PI3K和p-Akt表达明显下调。此外,与shFRMD6组比较,益气祛痰解毒方+shFRMD6组c-Met、p-PI3K和p-Akt表达显著下调。结论益气祛痰解毒方能够抑制肺癌细胞增殖、降低侵袭能力和促进细胞凋亡,其分子机制是通过FRMD6调控c-Met/PI3K/Akt通路来实现。

丹参二萜醌通过PERK-EIF2α通路诱导肺癌PC9细胞凋亡的机制研究

目的:探讨PERK-EIF2α通路在丹参二萜醌诱导肺癌PC9细胞凋亡中的作用。方法:采用0、2.5、5.0、7.5μg/mL丹参二萜醌处理PC9细胞24h后,CCK8法、Annexin V-FITC/PI双染色法分析细胞增殖活性及凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2,PERK-EIF2α通路相关关键蛋白,以及下游CHOP、ATF4蛋白表达水平;PERKsi RNA转染PC9细胞,Western blot检测PERK蛋白的转染结果,筛选出干扰效果最佳的片段。Annexin V-FITC/PI双染色法检测沉默PERK基因后丹参二萜醌对PC9细胞的凋亡情况,Western blot分析PERK-EIF2α通路相关关键蛋白的表达情况。结果:随着丹参二萜醌浓度的增加,PC9细胞增殖抑制作用增加,凋亡率显著增高(P<0.05);随着时间延长PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显增加,且以8h增加最为明显(P<0.05);其下游蛋白ATF4表达量逐渐减低,CHOP逐渐增高,呈剂量依赖性。PERK蛋白干扰后研究得到与干扰前相反的结果:与空载体组比较,丹参二萜醌诱导PC9细胞凋亡被明显抑制(P<0.05);PERK、EIF2α蛋白磷酸化水平明显降低(P<0.05),ATF4表达量有所增加,CHOP有所降低。结论:丹参二萜醌可触发PC9细胞内质网应激,其诱导细胞凋亡的机制与激活PERK/EIF2α通路密切相关。

miRNA-30/SMAD2信号通路抑制非小细胞肺癌对厄洛替尼敏感性的机制

目的研究微小RNA-30(miR-30)在人非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达情况和对肺癌细胞增殖、迁移能力和厄洛替尼耐药性的影响。方法 30例肺癌组织和癌旁组织标本由江苏省人民医院提供,人NSCLC细胞株PC9和PC9G由南京医科大学病理与病生实验室提供。首先,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)量化miR-30在30对NSCLC组织和癌旁组织中的表达水平,以及miR-30在肺癌细胞系PC9和PC9G[酪氨酸激酶抑制剂(TKI)耐药株]中的表达量,并计算其表达差异;在PC9G细胞中转染miR-30过表达试剂,PC9细胞系转染miR-30抑制剂,并各自设立阴性对照组;qRT-PCR检测转染效率;通过CCK-8试剂盒检测细胞增殖活性,克隆形成试验、Transwell侵袭试验、流式细胞仪测定miR-30对细胞增长、侵袭和凋亡等的影响;荧光素酶报告基因检测和Western blot鉴别磷酸化细胞信号转导分子(SMAD2)是否miR-30的靶基因。结果 miR-30在NSCLC组织中表达量明显低于癌旁组织(P<0.05),在耐药株PC9G中,miR-30表达量明显低于PC9细胞(P<0.01);在PC9G细胞中过表达miR-30可以减少细胞增殖和迁移,逆转细胞对厄洛替尼的耐药性。相反,抑制miR-30在PC9细胞中的表达可显著增加PC9细胞的增殖和迁移能力,并促使其产生对厄洛替尼的耐药性。结论 miR-30在人NSCLC组织中呈低表达,过表达miR-30可以抑制PC9G细胞的增殖迁移能力并逆转其对厄洛替尼的耐药性。此外,SMAD2可能为新的miR-30靶基因,在肺癌的发生发展中起着重要作用。