茂原链霉菌luxR基因对TGase生物合成的作用

前期研究表明,MgCl_2胁迫不但可以提高TGase的产量,还会影响微生物次级代谢产物合成的一个重要调节因子LuxR家族蛋白的表达.为了研究LuxR家族蛋白对茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)TGase生物合成以及菌体生长的调控作用,利用pKC1139为载体,构建luxR基因阻断质粒,通过PEG介导的质粒转化将其转入S.mobaraensis原生质体中,利用单交换同源重组法将整个重组质粒插入到茂原链霉菌基因组中构建S.mobaraensis luxR家族蛋白基因阻断突变菌.利用菌体干重法对比突变菌和野生菌菌体生长变化,利用比色法研究两株菌TGase生物合成的变化,找到LuxR家族蛋白基因表达与TGase生物合成之间的关系.结果发现,本研究采用单交换同源重组的方法可以成功地构建出S.mobaraensis luxR基因阻断突变菌株.通过对比野生菌与阻断菌株生长和TGase活力的变化发现阻断luxR基因会导致菌体生长受阻,TGase合成延迟,并且表达量显著下降.这些研究结果表明本文研究的luxR基因可能是S.mobaraensis合成TGase必不可少的正向调控因子.

两个luxR基因对洛蒙真菌素生物合成的影响

洛蒙真菌素是由洛蒙德链霉菌合成的具有广谱抗菌活性的吩嗪类化合物。luxR调控基因是细菌中一类非常重要的调控基因,广泛参与调控细菌的初级代谢和次级代谢过程。本研究分析了洛蒙德链霉菌S015中两个luxR基因luxR4和luxR13对洛蒙真菌素合成的影响。通过在野生株中单基因过表达luxR4与luxR13,发现这两个基因均能促进洛蒙真菌素的合成,菌株S015L4和S015L13中洛蒙真菌素的产量分别达到野生株的3.7倍和2.4倍。进一步通过luxR4和luxR13双基因共表达,得到高产洛蒙真菌素的菌株S015L4-13,其洛蒙真菌素的产量达到野生株的4.2倍,为(230.2±8.3)mg/L。结果表明,基因luxR4和luxR13对洛蒙真菌素的合成起正调控作用,且两个基因具有一定的协同作用。本研究为揭示洛蒙真菌素的合成的调控机制及高产菌株的构建提供了依据。

一个新型原核诱导表达系统的建立

群体感应是细菌依赖于种群密度进行信息交流、协调群体行为并调控基因表达的一种方式。海洋发光弧菌Vibriofischeri利用该机制合成化学物质N-酰基-高丝氨酸内酯(AHLs),与LuxR蛋白结合,随后驱动下游生物荧光基因的高量表达。基于植物叶绿体起源于原始古细菌-蓝藻的假设以及叶绿体内的转录、翻译机制与原核生物高度近似,构建了luxR基因调控下游报告基因GFP表达的叶绿体遗传转化载体。将该载体转入大肠杆菌后,当无外加信号物质AHLs时,GFP不表达;而外加AHLs后,GFP大量表达,证明luxR和GFP基因的组合在大肠杆菌中是理想的化学诱导基因表达系统,可应用于大肠杆菌基因功能的研究。