嗜肺军团菌lvgA基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

本实验采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增得到军团菌毒力基因(L eg ionellav iru lence gene,lvg A gene),并将其定向连接入克隆载体pUC 18,构建重组质粒pU lvgA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,再将lvgA基因亚克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pG lvgA,转化宿主菌JM 109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印记分析鉴定。实验结果表明,成功扩增出627 bp的lvgA基因,构建了重组质粒pU lvgA及原核表达重组质粒pG lvgA,并使53.7 KD a的G ST-lvgA融合蛋白质在原核系统中得到了有效的表达。

PCR介导嗜肺军团菌疫苗候选基因lvgA和Hsp60的融合及其在大肠杆菌中表达的初步研究

目的采用PCR法进行嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的拼接融合,克隆并检测该融合基因在原核系统中表达情况,为进一步研究其免疫性能作必要的准备。方法采用重组聚合酶链反应,设计引物首先分别从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得待融合端互补的军团菌毒力基因(lvgA)和热休克蛋白60基因(Hsp60),经琼脂糖电泳纯化回收,再以适量lvgA和Hsp60为模板变性、退火、重叠延伸,实现二基因的PCR水平融合,随后采用外引物进行新一轮扩增,扩得足量lvgA/Hsp60融合基因的PCR产物,继而将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒,转化宿主菌BL21,经PCR、酶切及测序鉴定后,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析等鉴定。结果扩增出了约2292bp的lvgA/Hsp60融合基因,构建了原核表达重组质粒pGlvgA/Hsp60,并检测到Mr约117000的GST-lvgA-Hsp60融合蛋白表达条带。结论采用PCR法实现了嗜肺军团菌lvgA和Hsp60二基因的融合,构建了其原核表达重组质粒,并使该融合蛋白在原核系统中得到了有效的表达,为进一步研究该融合基因的免疫学特性奠定了基础.

嗜肺军团菌lvgA基因分析及实时荧光定量RT-PCR对军团菌的检测

目的确定不同嗜肺军团菌lvgA基因序列的差异性及其感染宿主细胞后转录水平的变化,建立基于lvgA基因检测嗜肺军团菌的荧光定量RT-PCR。方法通过使用NCBI/Blast,Pfam,TMHMMServer v.2.0等网络资源分析嗜肺军团菌lvgA基因编码蛋白的保守功能结构域、跨膜区域。根据参考序列设计引物,采用PCR技术从嗜肺军团菌基因组DNA中扩增lvgA基因,将其连接入克隆载体pMD18-T进行测序,并用cltust软件比较不同嗜肺军团菌菌株lvgA基因的核苷酸、氨基酸序列。根据lvgA基因和嗜肺军团菌16SrDNA序列内的特异保守区域设计引物,以实时荧光定量RT-PCR检测嗜肺军团菌在感染人单核巨噬样细胞THP-1后lvgA基因转录水平的变化,同时,采用基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR对嗜肺军团菌患者血液样本进行检测。结果研究表明,嗜肺军团菌lvgA基因为军团菌毒力基因,其产物定位于外膜表面。不同嗜肺军团菌菌株中lvgA基因的核苷酸序列和氨基酸序列保守,相似度分别达:99%,96%,96%和99%,98%,98%。在感染宿主细胞后lvgA基因的转录水平上调明显,最高达4.3倍(P<0.05)。基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法可有效地检测嗜肺军团菌患者血液样本中的嗜肺军团菌。结论 lvgA基因与嗜肺军团菌的毒力相关,建立的基于lvgA基因的荧光定量RT-PCR方法具有快速、敏感、稳定等优点,适用于嗜肺军团菌肺炎临床实验室的早期诊断。

引入CpG基序的嗜肺军团菌lvgA基因真核表达质粒的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的构建了引入CpG基序的lvgA基因的真核表达质粒pclvgA/CpG,并在NIH3T3细胞中表达。方法采用PCR方法将特定CpG基序作为核酸佐剂构建于嗜肺军团菌lvgA基因侧翼,定向克隆入真核表达载体pcDNA3.1/myc-his(+),构建重组质粒pclvgA/CpG,体外阳离子脂质体转染法转染NIH3T3细胞。结果通过测序证实真核表达质粒pclvgA/CpG中lvgA/CpG克隆片段长为657bp,推测lvgA基因编码蛋白大小约为27.7Ku,lvgA基因及两侧翼原设计CpG基序完整扩出,测序序列与设计序列完全符合。用免疫荧光检测重组质粒在NIH3T3细胞中瞬时表达。结论本实验成功构建了嗜肺军团菌pclvgA/CpG真核表达质粒,并在NIH3T3细胞检测到其瞬时表达信号。