Purification and Characterization of Hyaluronate Lyases Produced by Two Types of Bacteria

Hyaluronate lyases were obtained from two types of naturally isolated bacterial strains Paenibacillus yunnanensis and Paennarthrobacter nicotinovorans.PyHL(form P.yunnanensis)in the culture supernatant of the bacteria was purified by two steps of column chromatography.The enzyme showed the molecular mass of 74 kDa by SDS-PAGE and the maximal activity at pH 5.0,35℃.PyHL maximally degraded hyaluronate by an endo-type manner,and showed low degradation activity toward chondroitin sulfates.Dermatan sulfate was not the substrate.PnHL(from P.nicotinovorans)in the culture supernatant of the bacteria was purified by two steps of column chromatography.The enzyme showed the molecular mass of 70 kDa by SDS-PAGE and the maximal activity at pH 6.0,30℃.Genomic analysis of P.nicotinovorans on the bases of the internal amino acid sequences of PnHL.

玉米苯丙氨酸解氨酶(PAL)家族基因分析及ZmPAL5的功能研究

【目的】挖掘玉米抗旱关键基因、揭示其抗旱分子机制,为培育抗旱玉米新品种提供基因资源和理论指导。【方法】采用转录组数据结合加权基因共表达网络(weighted gene co-expression network,WGCNA)与抗旱性生理生化指标的筛选方法,鉴定与抗旱和复水相关的ZmPAL基因。利用生物信息学方法对编码PAL的基因进行全基因组分析。运用实时荧光定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测ZmPAL基因在干旱处理条件下的表达情况,以及ZmPAL5在不同自交系间的表达特性和在不同组织中的表达模式。最后,利用遗传转化分析ZmPAL5在玉米中的抗旱功能,并借助CRISPR/Cas9技术对PAL5同源基因进行缺失型拟南芥突变体的抗旱性分析。【结果】鉴定了19个玉米ZmPAL基因,其中6个基因聚集在第5染色体上,其编码蛋白多为亲水性酸性蛋白,且PAL家族基因的进化相对保守。ZmPAL基因启动子区域含有大量与激素和非生物应激响应相关的顺式作用元件。确定了6个核心基因,其中4个基因在干旱处理后显著上调表达。尤其是ZmPAL5在干旱胁迫后表达量增加了8.57倍。在干旱胁迫和复水处理条件下,发现抗旱自交系郑8713中ZmPAL5的表达水平显著高于旱敏感自交系B73。同时,ZmPAL5是一个组成型表达基因,在幼茎中表现出高水平的表达。过表达ZmPAL5玉米在干旱胁迫下生长良好,其相对含水量、木质素、叶绿素、可溶性蛋白、脯氨酸含量,以及超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶和抗坏血酸过氧化物酶的活性分别是野生型的1.52、1.49、1.47、1.43、1.44、1.41、1.53、1.41和1.35倍,但丙二醛含量是野生型的0.65倍。PAL5缺失型拟南芥突变体对干旱敏感。在干旱胁迫下,其生理生化指标与过表达ZmPAL5玉米的指标变化趋势相反。【结论】筛选出6个响应干旱胁迫的核心基因(ZmPAL3、ZmPAL5、ZmPAL6、ZmPAL8、ZmPAL11和ZmPAL13),其中,ZmPAL5的表达量与抗旱性呈正相关。ZmPAL5通过影响渗透调节物质含量和抗氧化酶活性正向调节植物的抗旱性和恢复能力。

儿童期17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症的临床及遗传学特征

目的探讨17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症(17α-hydroxylase/17,20-lyase deficiency,17OHD)在儿童期的临床及遗传学特征。方法回顾性分析2016年1月至2022年12月在郑州大学附属儿童医院确诊的4例17OHD患儿的临床表现、实验室及影像学检查结果、基因突变特点,并结合文献进行汇总分析。结果4例患儿确诊时,年龄为11月21天至10岁6月;染色体核型均为46,XY;社会性别为男性1例,女性3例;主诉为阴茎短小1例、腹股沟肿块1例、高血压2级2例;彩超检查分别在阴囊、腹股沟、腹股沟内环口发现睾丸3例。4例患儿8点皮质醇、睾酮、雄烯二酮水平均降低,促肾上腺皮质激素、孕酮、促黄体生成素、卵泡刺激素水平均升高,17羟孕酮均正常。3例患儿血钾轻度减低(3.44~3.48 mmol/L)。CYP17A1纯合突变1例,复合杂合突变3例,其中c.563 A>G和c.436+1G>T为未报道过的新突变位点,3例均存在c.985_987delinsAA变异;4例均接受口服氢化可的松治疗。结论外生殖器异常、腹股沟/阴唇包块及高血压是46,XY的17OHD儿童期的主要表现,早期规范治疗可减少并发症,CYP17A1 c.985_987delinsAA变异可能为我国17OHD患儿的热点变异。

响应面法优化褐藻胶降解菌Cobetia sp.20发酵培养基

为了提高褐藻胶降解菌株Cobetia sp.20产褐藻胶裂解酶的能力,利用响应面法优化其发酵产褐藻胶裂解酶的培养基。首先利用单因素法分别对发酵培养基中的不同碳源、碳源添加量、不同氮源、氮源添加量以及氯化钠添加量、磷酸二氢钾添加量、硫酸镁添加量和pH进行探究,研究各因素对产酶的影响。在单因素实验的基础上,通过Plackett-Burman试验确定Cobetia sp.20发酵培养基中影响产酶的主要因素。通过响应面试验建立回归方程。研究结果表明,Cobetia sp.20最优发酵培养基配方为褐藻胶15.00 g/L、硫酸铵7.50 g/L、氯化钠15.00 g/L、硫酸镁0.50 g/L、磷酸二氢钾5.30 g/L、硫酸亚铁0.01 g/L、pH值7.58。优化后酶活为142.79 U/mL,比优化前提高了26.36%。褐藻胶裂解酶活的提高,为褐藻胶裂解酶的工业化生产提供了参考。

蓝莓不同硬度果实VcPLs基因克隆和功能研究

【目的】探究果胶裂解酶基因在蓝莓硬肉品种和软肉品种果实硬度差异中的作用,为选育高硬度蓝莓品种提供参考。【方法】以蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal不同发育时期的果实为材料,测定果实硬度、细胞壁物质含量和果胶裂解酶活力,分析比较果肉细胞解剖结构,克隆果胶裂解酶基因并研究其表达模式,转化番茄验证VcPL的功能。【结果】S4(膨大期)到S6(红果期)时期是果实硬度快速下降关键时期,果肉细胞在发育初期细胞壁轮廓清晰,Star果肉细胞出现结构破损的时期晚于O’Neal,果实硬度与可溶性果胶含量、果胶裂解酶活力均呈极显著负相关,VcPL41和VcPL65编码区序列长度分别为1230 bp和1209 bp,Star和O’Neal中VcPL65氨基酸序列完全相同,VcPL41的序列在品种间有4个氨基酸差异。2个基因在Star中快速上调表达的时期晚于O’Neal。超表达VcPL41和VcPL65的番茄果实硬度显著小于对照组,可溶性果胶含量显著高于对照组。【结论】蓝莓硬肉品种Star和软肉品种O’Neal果实硬度差异受果胶裂解酶活力和可溶性果胶含量影响,VcPL41和VcPL65能够加速果实成熟软化进程。

噬菌体裂解酶基因Lys BT1在普通小球藻中的表达

噬菌体裂解酶因高效、安全的杀菌特性成为潜在的抗菌药物,并受到广泛关注。本试验在前期通过基因表达制备高效噬菌体裂解酶Lys BT1的基础上,深度解析Lys BT1与细菌上裂解酶受体相互作用的结构特点,成功构建出质粒pCAMBIA 1301-BT1。将该质粒通过电转化的方式导入普通小球藻中,电转条件为:电场强度1.5 kV、脉冲距离2 mm、脉冲时间0.2 ms,瞬时表达后成功进行了活性测定,从而验证了普通小球藻作为裂解酶表达载体的可行性,为噬菌体裂解酶的表达系统研发提供了一条可行路径。

代谢工程改造酿酒酵母发酵生产β-胡萝卜素

β-胡萝卜素属于多烯烃类,是水果和蔬菜中含量最高的类胡萝卜素,能够预防并减轻心脏病,白内障和癌症等疾病,市场需求量较大,利用生物合成法生产β-胡萝卜素具有较好的应用前景。胞质乙酰辅酶A是β-胡萝卜素合成的重要前体,如何提高胞质乙酰辅酶A的含量是高效合成β-胡萝卜素的关键。该研究利用米曲霉(Aspergillus oryzae)来源的ATP-柠檬酸裂解酶基因(ATP-citrate lyase,ACL)转化出发菌株ZS20,同时过表达酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)自身CAB 1基因,从而增加胞质乙酰辅酶A含量,β-胡萝卜素产量显著提高,菌株L5的摇瓶发酵产量达到333.3 mg/L,是出发菌株的2.1倍。在此基础上,菌株L5回补缺陷的腺嘌呤、赖氨酸、亮氨酸和色氨酸合成关键基因得到菌株L11,β-胡萝卜素摇瓶发酵产量为378.1 mg/L。经发酵罐发酵优化后,产量提高到1152.7 mg/L。

褐藻寡糖的酶法制备及其在水产养殖中的应用

褐藻寡糖(AOS)是一类由2~10个单糖分子经相同或不同糖苷键连接而成的低分子量聚合物。褐藻胶裂解酶是酶法制备AOS的重要工具,酶法制备的AOS在纯度、性能、结构方面优于其他方法制备的AOS。文章综述了褐藻胶裂解酶的来源、结构及酶学性质,总结了酶法制备的AOS在饲料添加剂、微藻培育、免疫调节、抗氧化和抗菌等水产养殖方面的应用,对褐藻胶裂解酶的研究方向以及AOS在水产养殖中的应用前景进行了展望,为褐藻胶裂解酶、AOS在水产养殖中的应用提供参考。

茉莉花PAL基因家族的多基因组鉴定与表达分析

为深入探究茉莉花PAL基因家族的功能及在香气成分形成中的作用,本研究以福州单瓣茉莉花、双瓣茉莉花和重瓣茉莉花基因组数据为基础,利用生物信息学方法及实时荧光定量PCR技术,对JsPAL基因家族进行多基因组分析。结果表明,在单瓣茉莉花、双瓣茉莉花和重瓣茉莉花全基因组中分别鉴定出4个、1个和4个PAL家族基因,JsPAL家族成员均具有丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)组成的三肽活性中心。共线性分析发现单瓣茉莉花、重瓣茉莉花和拟南芥的PAL基因间的共线性关系与双瓣茉莉花相比更强;系统发育树分析结果显示,JsPAL基因家族分布在2个亚家族中。JsPAL基因启动子区域存在大量与胁迫响应、激素响应、光响应和植物生长相关的顺式调控元件。荧光定量分析结果表明,JsPAL在茉莉花组织中存在特异性表达,多数JsPAL在花中的相对表达量高于其他组织;大多数JsPAL基因在福州单瓣茉莉花中的相对表达量高于双瓣茉莉花;福州单瓣茉莉花中SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1和MP_JsPAL3在其花朵预开放期(F3)的相对表达量显著高于其他时期,双瓣茉莉花中DP_JsPAL1在F3阶段的相对表达量也较高;SP_JsPAL1和SP_JsPAL2与2-苯乙醇和苯乙醛含量呈显著正相关,其中SP_JsPAL1还与苯甲醛含量呈显著正相关。说明,JsPAL可能在茉莉花的发育中起重要作用,SP_JsPAL2、SP_JsPAL4、MP_JsPAL1、MP_JsPAL3和DP_JsPAL1可能对福州单瓣茉莉花、双瓣茉莉花的香气成分形成具有重要的调控作用,SP_JsPAL1可能对福州单瓣茉莉鲜灵香气的形成具有重要作用。

麻类脱胶高效菌株DCE01的Pel4I8基因克隆与表达

从麻类脱胶高效菌株DCE01中克隆出一个果胶酶基因Pel4I8,采用表达载体p ET-28a,在E.coli BL21(DE3)中成功表达。实验结果表明,底物(橘子果胶)的酯化度对酶活有较大影响,用酯化程度在55%-70%的橘子果胶作底物时酶活最高(酶活为17.5U/ml);胞内酶最适反应温度为55℃,最适反应p H为9.5。该结果可为深入发掘DCE01菌株的基因资源提供重要科学依据。

大豆孢囊线虫果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5的克隆与分析

【目的】克隆和分析与大豆孢囊线虫寄生密切相关的果胶酸裂解酶新基因,为研究大豆孢囊线虫寄生和致病的分子机理提供依据,并为探讨大豆孢囊线虫的防控新途径提供理论基础。【方法】通过EST分析结合RACE-PCR扩增方法,从大豆孢囊线虫中克隆出1个果胶酸裂解酶新基因;通过原位杂交和半定量PCR的方法确定基因的表达部位和分析不同发育阶段的基因表达;采用Southern杂交方法分析基因的拷贝数。【结果】从大豆孢囊线虫中克隆出1个全长为957个碱基编码227个氨基酸残基的新果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5(GenBank登录号HQ123259)。Hg-pel-5基因组由2个外显子和1个内含子组成。预测蛋白含有20个氨基酸残基的信号肽和4段细菌结构的果胶酸裂解酶第三家族的保守位点。原位杂交确定Hg-pel-5在大豆孢囊线虫亚腹食道腺中表达。半定量RT-PCR结果表明Hg-pel-5在寄生前和寄生过程早期的2龄幼虫大量表达。Southern杂交结果显示Hg-pel-5存在于大豆孢囊线虫基因组中并以多拷贝形式存在。【结论】对大豆孢囊线虫中1个新的果胶酸裂解酶基因Hg-pel-5进行克隆和分析,表明该基因在大豆孢囊线虫早期寄生过程中发挥重要作用。

象耳豆根结线虫果胶酸裂解酶新基因Me-pel2的鉴定及发育表达分析

利用EST结合RACE方法从象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)中克隆一个新的果胶酸裂解酶基因Me-pel2(Gen Bank登录号KP987180)。Me-pel2 c DNA开放阅读框全长834 bp,推导编码277个氨基酸残基的蛋白,属于多糖裂解酶第III家族新成员。Me-PEL2与南方根结线虫果胶酸裂解酶Mi-PEL3氨基酸具有较高的一致性,为54%。发育表达结果显示,Me-pel2在2龄幼虫和雄虫期高丰度表达,而在固着期寄生阶段转录水平急剧下降,推测Me-pel2主要在象耳豆根结线虫迁移性阶段起重要作用,通过降解寄主细胞壁果胶质成分,协助幼虫侵入寄主以及在寄主体内迁移。

碱性果胶裂解酶基因pelA在E.coli中的表达和酶学性质研究

根据核苷酸序列分析结果设计引物 ,通过 PCR的方法 ,在嗜碱芽孢杆菌 NTT3 3的总 DNA和 p13 5 0中分别扩增到预计大小的片段 ,证明 p13 5 0中的外源 DNA片段来自于嗜碱芽孢杆菌 NTT3 3 .同时也获得了含有pel A完整 ORF的 DNA片段 .经计算 ,该基因表达的成熟蛋白质的分子量为 3 4 .76× 10 3.构建表达载体 p BV2 2 0 -pel,在 E.coli DH5α中进行表达 .SDS- PAGE检测发现 ,表达的蛋白质分子的大小约为 3 5× 10 3,与预测的相符 .初步研究其酶学性质发现 ,该酶在 p H 9.0～ p H10 .0 ,4 5°C的条件下有较高的活性 ,而且必需 Ca2 + 参与反应 .

果胶裂解酶基因PelC表达载体的构建及原核表达分析

从实验室分离保存的1株产果胶酶的菌株(BTC105)中克隆果胶裂解酶基因(PelC)完整开放阅读框,通过载体构建,将目的基因连接到表达载体pET28a上,转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行融合表达,在LB(Luria-Bertani)中进行摇瓶发酵,1 mmol/L IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导。结果表明,构建了表达载体pET28a-pelC,果胶裂解酶主要在胞内表达,酶活最适pH为5.4,最适温度为50℃,Ca^(2+)对酶活促进作用最为明显,Cu^(2+)完全抑制了酶的活性。

海洋细菌Pseudoalteromonas sp.01中新型褐藻胶裂解酶AlyPC1的研究

为挖掘新型褐藻胶裂解酶,使其开发成为制备褐藻寡糖的工具酶,本研究中表征了来源于海洋细菌Pseudoalteromonas sp.01的褐藻胶裂解酶AlyPC1。本文作者在生物信息学分析的基础上,对AlyPC1进行了重组表达及酶学性质的研究。序列比对结果显示,AlyPC1是PL7家族第五亚家族的一个褐藻胶裂解酶。酶学性质研究发现:AlyPC1最适反应温度为35℃,将AlyPC1置于5~30℃孵育1 h,仍保留80%以上的酶活;在Tris-HCl缓冲液中,AlyPC1最适反应pH为8.0,当pH在7.5~9.0之间时,酶活保留了90%以上,证明AlyPC1具有良好的温度稳定性以及宽泛的pH耐受性;反应体系中NaCl的含量为200 mmol/L时,AlyPC1的酶活最高;乙二胺四乙酸(EDTA)以及一些金属离子如Mn^(2+)、Zn^(2+)和Ni^(2+)等能够明显抑制AlyPC1的活性。AlyPC1能够降解褐藻胶、polyG以及polyM三种底物,因而说明AlyPC1是一种双功能褐藻胶裂解酶。同时,AlyPC1以内切的形式降解褐藻胶,产生二糖、三糖以及四糖。

普通变形杆菌噬菌体裂解酶Lys66的表达纯化及活性分析

目的:对一株新型普通变形杆菌噬菌体中的裂解酶Lys66进行基因克隆、蛋白表达纯化及活性分析。方法:将噬菌体全基因序列在Genbank数据库中进行对比,挖掘出裂解酶基因序列,并对其进行克隆,进一步在大肠杆菌中表达蛋白并纯化,探究其抑菌效果。结果:通过比对挖掘出与裂解酶相似度较高的基因序列,大小为393 bp;利用ExPAsy Bioinformatics Resource Portal预测裂解酶的分子质量为15.20 kDa,等电点为9.40,由130个氨基酸组成,将优化的合成基因构建到载体pET-32α中,得到重组质粒pET-32α-lys66,并将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后诱导其表达,经纯化验证后,获得1.86 mg/mL的重组裂解酶Lys66蛋白。裂解酶Lys66在平板上的抑菌圈直径为19.30 mm;对15株受试菌株中的13株经氯仿处理的革兰氏阴性菌均表现出裂解活性,宿主谱较广。Lys66(1.89 mg/mL)与乙二胺四乙酸(1 mmol/L)联用,2 h后OD_(600 nm)下降0.61,抑菌效果较好。结论:本研究重组表达的裂解酶Lys66具有良好的抑菌效果,可作为一种潜在的抗菌剂。

一种新型褐藻胶裂解酶及其截短体对酶学性质的影响

褐藻寡糖是褐藻胶的降解产物,因独特的理化性质而具有抗肿瘤、促进生长和调节免疫等功效,受到广泛关注。为了挖掘更高效的褐藻胶裂解酶用于制备褐藻寡糖,对采集于海边土壤中的微生物进行筛选,以获得能够降解褐藻胶的菌株,并从其基因组中克隆表达出褐藻胶裂解酶,考察酶的催化特性。结果发现:从Paenibacillus lautus A2中鉴定出的一种新颖的褐藻胶内切酶AlgC2m,含有439个氨基酸,与PL7家族的AlgL仅有38%的最高序列一致性,其N端的碳水化合物结合模块(CBM32)和C端催化域(CD)通过一个连接子连接。AlgC2m和其截短体AlgC2m-CD降解褐藻酸钠的酶活分别为331.05和82.47 U/μmol,最适温度分别为45和30℃。另外,AlgC2m-CD对聚α-L-古罗糖醛酸(polyG)具有更明显的偏好性,酶解产物除二糖和三糖外,还有聚合度更高的四糖。

麻类脱胶高效菌株DCE01的Pel325基因克隆与表达

采用软件Primer premier 5设计引物,从麻类脱胶高效菌株DCE01中克隆出一个果胶酶基因Pel325,重组到表达载体p ET-28a中,在E.coli BL21(DE3)中成功表达。试验结果显示,酶的活性随着底物(橘子果胶)酯化程度的增加而增加。胞内酶用酯化程度≥85%的橘子果胶作底物检测时酶活最高(酶活为37.5U/ml),其最适反应温度为55℃,最适反应p H为8.0。该结果可为进一步发掘DCE01菌株的基因资源提供重要科学依据。

表面偶极离子亲水磁珠固定化异柠檬酸裂解酶及其表征

比较两种亲水磁珠固定化结核分枝杆菌异柠檬酸裂解酶(Mycobacterium tuberculosis isocitrate lyase,Mt ICL)并优化,为天然产物中Mt ICL先导抑制剂的亲和富集筛选提供适用的固定化酶。构建6×His-pET28a-ICL,经E.coli BL21(DE3)重组表达、Ni^(2+)-NTA柱纯化和酶学性质表征获得Mt ICL(重组蛋白质)。用羧基功能化和Ni^(2+)-NTA功能化制备两种表面偶极离子亲水磁珠固定化Mt ICL,比较其固载量、酶活力、稳定性及对已知抑制剂的响应。羧基磁珠固定化酶表观保留比活显著高于Ni^(2+)-NTA固定化酶。当羧基磁珠与重组蛋白质加样质量比为60∶1时,固定化酶表观保留比活可达游离酶的85%,此时羧基磁珠对Mt ICL表观固载量为(7.2±0.2)mg/g(以磁珠质量计,n=3)。羧基磁珠固定化Mt ICL对衣康酸的亲和力与游离酶无显著差异(P>0.05),且稳定性更强。此羧基磁珠固定化Mt ICL可望作为磁分离、亲和富集筛选天然产物中Mt ICL抑制剂类抗结核先导化合物。

高产果胶酶细菌的筛选及其Pel基因克隆

用透明圈法筛选50份产果胶酶菌株,通过PCR方法从菌株的基因组DNA克隆果胶酶Pel基因,Pel基因与PMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌DH52α,用菌落PCR方法和透明圈法筛选阳性重组菌株。结果表明,成功筛选出一株透明圈大的T85-166菌株,初酶液果胶酶活力达213.30U/ml,克隆了877bp的Pel基因片段并在大肠杆菌DH52α中有表达,其表达产物具有生物学活性。