梓葛冻干粉针抗血栓作用实验研究

基于地黄和葛根在中医临床治疗中风疾病的广泛应用[1]及其现代药理学作用[2-3],课题组前期将其药效成分梓醇和葛根素配伍,研制成治疗脑缺血中风的新药--梓葛冻干粉针（lyophilized powder of catapol and puerarin,C-P）.

梓葛冻干粉针的安全性药理学实验

梓葛冻干粉针（lyophilized powder of catalpol and puerarin,C-P）为西南大学中药研究所自主研发的用于治疗脑缺血卒中的一种新型中药单体复方制剂,其主要成分为梓醇和葛根素.研究表明,C-P能通过血脑屏障,可明显减少缺血性脑中风模型小鼠大脑梗死体积百分比,还能抑制血小板聚集,促进血凝块溶解,保护神经细胞,改善神经细胞损伤后的生长形态.

梓葛冻干粉针抗脑神经血管单元炎症及氧化损伤

由梓醇和葛根素配伍制成的抗缺血性中风新药--梓葛冻干粉针（injection of lyophilized powder with catalpol and puerarin,C-P）,可透过血脑屏障并且是安全的[1-2],可明显减少中风模型小鼠大脑梗死灶面积[3].

葛根素纳米粉体的制备及质量评价

目的制备葛根素纳米冻干粉,并对其进行质量评价。方法通过对冻干保护剂、冻干时间、预冻温度等的单因素考察,选择葛根素纳米冻干粉的最佳制备工艺,并对冻干粉的理化性质、纳米形态和质量进行评价。结果葛根素纳米粉体的最佳成型工艺为:以甘露醇为冻干保护剂,置-80℃冰箱中预冻12h,然后在-40℃、5Pa下真空冷冻干燥36h升华水分。制备的纳米粉体具有良好的溶解性能,平均粒径为108nm,表面电位为-24.3mV,平均含量约为140mg/g。结论采用冻干技术制备葛根素纳米粉体技术可行。

口服葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉的制备及其4种有效成分溶出度考察

目的制备葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉,并考察其主要有效成分(3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元)的溶出度。方法采用高压均质法制备葛根总黄酮纳米混悬液,以甘露醇为冻干保护剂制备冻干粉,以人工胃液(pH 1.2)为溶出介质,考察葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉及其物理混合物中葛根素、3′-羟基葛根素、大豆苷和大豆苷元的溶出度。结果单因素试验并验证制备葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉,其粒径、多分散指数及Zeta电位分别为(479.7±14.7)nm、0.524±0.220及(29.68±3.97)mV。葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉4种有效成分的溶出速率显著高于其物理混合物。结论葛根总黄酮纳米混悬液冻干粉制备方法简便,能显著提高主要有效成分的溶出速率,有望成为葛根总黄酮的新型纳米给药系统。

梓葛冻干粉针抗脑缺血“神经血管单元”多细胞凋亡的机制

目的:研究梓葛冻干粉针(C-P)抗脑缺血"神经血管单元"(NVU)多细胞凋亡的机制。方法:通过线栓法制作的脑缺血再灌注(I/R)损伤大鼠模型,氧糖剥夺再灌注(OGD/R)损伤的体外NVU模型,采用形态学和免疫学方法,研究C-P抗缺血NVU多细胞凋亡的机制。结果:在I/R损伤模型大鼠实验中,49.00、24.50、12.25μg/m L的C-P均能显著抑制Cleaved Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表达(P<0.01,P<0.05),降低缺血区神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞凋亡率(P<0.01),减少梗死灶体积百分比(P<0.01),提高大鼠神经行为学得分(P<0.01)。在OGD/R损伤NVU体外模型实验中,49.00、24.50μg/m L的C-P均能显著抑制Cleaved Caspase-3、Caspase-3和Bax蛋白表达(P<0.01),降低神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞的凋亡率(P<0.01),增加神经元轴突长度以及星形胶质细胞和微血管内皮细胞的存活数量(P<0.01)。结论:C-P可同时抑制神经元、微血管内皮细胞和星形胶质细胞凋亡,促进其存活,对NVU具有整体保护作用,从而减少缺血区梗死灶体积,起到改善大鼠神经行为学功能的效果。

口服葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉的制备及其4种成分释放度考察

目的制备口服葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉并考察其主要有效成分3′-羟基葛根素、葛根素、大豆苷和大豆苷元的释放度。方法采用高压均质法制备葛根总黄酮固体脂质纳米粒混悬液,以甘露醇为冻干保护剂制备冻干粉,以人工胃液(pH 1.2)为溶出介质,考察葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉中4种有效成分的释放度。结果正交试验优选制备工艺:脂质-表面活性剂比例及用量为2∶1及2.0%、葛根总黄酮用量2.5%、150 MPa均质15次,并制备葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉,其粒径、多分散指数及Zeta电位分别为(517.1±10.3)nm、0.484±0.210及(-21.91±2.03)mV。葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉中4种有效成分的释放速率显著低于其物理混合物,具有明显的缓释特征。结论葛根总黄酮固体脂质纳米粒冻干粉制备方法简便,能显著延缓主要有效成分的释放速率,有望成为葛根总黄酮的新型纳米给药系统。

梓葛冻干粉针对体外氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用

目的探讨梓葛冻干粉针(C-P)对体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用及可能的机制。方法原代分离培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞的纯度。实验分正常组、模型组、辅料组、C-P:12.25、24.50、49.00μg·m L-1组。对星形胶质细胞进行OGD 6h/R 12h损伤并同时给予C-P。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡率。利用试剂盒的方法分别检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及一氧化氮(NO)的释放量,ELISA法测定细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和前列腺素(PG)E2的含量,Western blot检测细胞内caspase-3,诱导型一氧化氮合酶(i NOS),环氧酶(COX)-2,核因子(NF)-κB p65,p-NF-κB p65,IκB-α,p-IκB-α蛋白表达量。结果原代培养的星形胶质细胞纯度在97%以上。与正常组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH漏出率及细胞凋亡率明显增高;细胞内SOD活性和GSH含量明显降低,MDA和ROS含量显著升高;细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1β和PGE2的释放量也显著增加。而以上相关生化指标均可被不同剂量的C-P所抑制。辅料组与模型组无显著差异。进一步研究发现,C-P能显著抑制OGD/R损伤引起的细胞中caspase-3、i NOS、COX-2蛋白表达量及NF-κB p65和IκB-α的磷酸化水平的增高。结论 C-P对体外OGD/R损伤的星形胶质细胞具有保护作用,其保护机制与其抗炎、抗氧化以及抑制细胞凋亡和NF-κB信号通路的激活有关。

甘草酸为稳定剂的葛根素纳米乳冻干粉的制备及体外评价

目的以天然表面活性剂甘草酸为稳定剂制备葛根素纳米乳冻干粉(puerarinnanoemulsionlyophilizedpowder,Pue-NE-LP),并对其进行体外评价。方法采用高速剪切联合高压均质法制备葛根素纳米乳(Pue-NE),进一步结合冷冻干燥法制备Pue-NE-LP。以平均粒径和多分散指数(PDI)作为评价指标,通过单因素试验筛选出最优处方及工艺参数。并对制备的Pue-NE-LP进行理化性质表征和体外溶出度测定。结果以5%辛癸酸甘油酯为油相,2.0 mg/mL甘草酸为稳定剂,7%葡萄糖为冻干保护剂制得的Pue-NE-LP平均粒径为(215.1±0.7)nm,PDI为0.133±0.024。扫描电镜显示Pue-NE-LP呈不规则的小片状,大小较均匀;X射线衍射显示Pue-NE-LP呈无定型状态存在。体外释放结果表明Pue-NE-LP的溶出度明显高于物理混合物。结论以天然表面活性剂甘草酸为稳定剂制备的Pue-NE-LP,不仅制备方法简单,而且能显著改善Pue的溶解性和生物利用度,为Pue-NE制剂的多元开发提供参考。

共载同源成分葛根素与大豆苷元的聚合物混合胶束的制备及表征

目的鉴于葛根黄酮类成分间溶解性与渗透性的自调节作用,以泊洛沙姆407(Pluronic F127,F127)和15-羟基硬脂酸聚乙二醇脂(Solutol HS15)为载体材料制备共载葛根素与大豆苷元的聚合物混合胶束(puerarin and daidzein co-delivery polymer mixed micelles,PD-FS/PMMs)及其冻干粉,以实现同源成分共载。方法采用薄膜水化法制备PD-FS/PMMs,以胶束稳定性为考察指标进行了处方工艺优化;应用核磁共振氢谱、透射电子显微镜与激光粒度仪等对其进行物理性能表征,并通过体外透析法考察药物释放情况。为了进一步提升胶束相关口服制剂的成型性,还对胶束溶液进行了冻干处理并基于外观与复溶效果考察了冻干保护剂的种类与用量,同时开展了冻干粉的性能表征研究。结果成功制备了PD-FS/PMMs,最佳处方为葛根素与大豆苷元的投药量分别为80.98、3.46 mg,载体总量为200 mg,其中,F127质量分数为77.30%;制备的胶束外观圆整,粒度均匀,粒径为18~20 nm,且2种成分的体外释放互不影响;确定了胶束溶液的最佳冻干工艺是以40 mg/mL甘氨酸作为冻干保护剂,冻干粉形态以片状为主且复溶效果好。结论研究不仅解决了不同疏水性成分共载的难题,且实现了同源成分共载胶束的制备,为后期开展葛根素口服降压制剂的体内研究与临床开发奠定基础,并为旨在高生物利用度的共载制剂体系的设计提供共载成分筛选的新思路。