溶葡萄球菌素基因乳腺特异表达载体的构建与检测及转基因核供体细胞的制备

本研究旨在构建溶葡萄球菌素基因牛乳腺特异表达载体(pEPB),转染牛胎儿成纤维细胞,为制备溶葡萄球菌素基因的转基因克隆牛提供核供体细胞。本研究以pEGFP-C1为载体骨架,通过PCR扩增牛2.6kb的β-酪蛋白5′调控区及0.6kb的3′侧翼区(poly A)序列作为调控序列,制备成含有绿色荧光和新霉素筛选标记的牛乳腺特异表达载体,经PCR和酶切鉴定正确后,用转染试剂FuGene HD反复转染牛pEPB乳腺上皮细胞3～5次,用催乳素诱导后,经免疫荧光分析,检测目的蛋白的表达。然后,用电转染法转染牛胎儿成纤维细胞,经G418筛选得到阳性细胞后,把阳性细胞扩大培养并提取其基因组,因为溶葡萄球菌素基因是外源基因,经PCR及Southern blot检测来确定目的基因是否已经整合到细胞的基因组上。结果表明,溶葡萄球菌素基因在牛乳腺细胞中得到了表达,并整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组中,得到了转溶葡萄球菌素基因的核供体细胞。结果显示,本研究所获得的转基因牛胎儿成纤维细胞可作为体细胞核移植的供体细胞进行转基因克隆牛研究。

重组溶葡萄球菌酶体外诱导的金黄色葡萄球菌耐药株生物学特征

目的：探究重组溶葡萄球菌酶体外诱导金黄色葡萄球菌（金葡菌）耐药发生规律和机制。方法用3株临床分离金葡菌，体外以亚抑菌浓度重组溶葡萄球菌酶一步法诱导耐药，观察耐药株对多种抗菌药物的药敏改变情况，测序分析肽聚糖甘氨酸五肽桥联的关键合成酶编码基因 femABX。并观察其中1株耐甲氧西林金葡菌（MRSA）和1株甲氧西林敏感金葡菌（MSSA）的生长曲线、小鼠感染毒力情况。结果金葡菌耐药发生频率为10－4～10－8水平，与原代株比较，耐药株体外生长速率和小鼠体内毒力显著降低，对β内酰胺类敏感性提高2～4000倍。测序结果显示耐药株 f emA编码基因存在突变，可致终止密码子提前。结论重组溶葡萄球菌酶体外可诱导金葡菌耐药性产生，但耐药株生长繁殖力、致病力及抵抗β内酰胺类抗生素的能力显著降低。