中慢生型天山根瘤菌MsiR组成型蛋白突变株的筛选

MsiR蛋白来源于中慢生型天山根瘤菌(Mesorhizobium tianshanense),是Lys R转录调控蛋白家族中的一员,它可以响应宿主植物释放的抗代谢物-刀豆氨酸,激活外运蛋白msiA编码基因的转录表达。通过构建MsiR突变文库,筛选得到了7个MsiR组成型突变蛋白,L166P、A147V、P83L、A278T组成型突变蛋白丧失了对刀豆氨酸的响应,在没有刀豆氨酸时的荧光值为800左右;A147T、E59G组成型突变蛋白仍然可以响应刀豆氨酸的诱导信号,添加刀豆氨酸时荧光值是未添加时的1.7倍。通过蛋白同源建模分析了组成型突变的氨基酸残基在MsiR蛋白上的空间分布及其对MsiR蛋白调控功能可能的影响。组成型突变蛋白的研究对进一步揭示LysR家族蛋白转录调控的机理有重要意义。

MsiR高可溶性蛋白突变株的筛选

外源蛋白在表达宿主中的可溶性是影响其应用的关键因素。采用m Cherry报告基因,构建Msi R-m Cherry融合蛋白,通过测定荧光值定性定量的测定Msi R蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。随后,利用易错聚合酶链反应(Errorprone-PCR)和致突变菌株(XL1-Red)两种方式构建了msi R-m Cherry基因突变文库,经筛选得到了4株在大肠杆菌中以37℃作为诱导温度下可溶性明显提高的蛋白突变体。