基于mCherry荧光蛋白的植物基因过表达遗传转化系统的初步研究

过量表达是植物基因功能鉴定和农作物遗传改良的重要途径。为了提高转基因植株的研究效率,以m Cherry红色荧光蛋白为报告基因,构建了由玉米泛素启动子(P-Ubi)和豌豆T3A-poly A序列组成过量表达框的转基因载体。分别将4个水稻类受体激酶的编码序列插入表达框,通过农杆菌介导转化水稻品种泰粳394。转基因植株T1种子的m Cherry荧光检测结果表明,平均62.5%的T1株系呈3∶1分离。根据实时定量RT-PCR分析结果,过表达阳性植株的目的基因相对表达量显著高于阴性植株和未转化的泰粳394。运用该载体系统,能够进行转基因后代大规模筛选,获得目的基因过量表达的转基因株系,从而促进植物基因功能研究和转基因应用研究。

利用mCherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子体外活性质粒的构建及应用

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌感染引起的人畜共患传染病,对养殖业的发展和人类的公共健康安全有着严重的危害。由VirB编码的Ⅳ型分泌系统(T4SS)为布鲁氏菌重要的毒力因子,布鲁氏菌侵染细胞后,吞噬体酸化被证实是VirB启动T4SS的主要信号,利用m Cherry红色荧光蛋白作为报告基因,构建可以在体外酸性环境中检测VirB启动子活性的质粒,对于研究布鲁氏菌毒力基因的表达具有重要意义。以pBE-1质粒为骨架,构建质粒pBE-1-VirB-m Cherry,以pBE-1-ptrc-m Cherry质粒为阳性对照,通过电穿孔法转入布鲁氏菌S2株中,构建工程菌株S2(pBE-1-ptrc-m Cherry)和S2(pBE-1-VirB-m Cherry)。体外酸性环境下诱导工程菌株S2(p BE-1-VirB-m Cherry),结果显示,m Cherry荧光蛋白可以精准地报告VirB启动子的活性。结果表明,构建了利用m Cherry荧光蛋白报告布鲁氏菌VirB启动子活性的质粒,并验证m Cherry荧光蛋白可以精准反应布鲁氏菌VirB启动子在体外的活性,为研究布鲁氏菌毒力基因,揭示其Ⅳ型分泌系统致病机制奠定基础。

荧光增白剂与人血清白蛋白相互作用的多种光谱法及分子对接技术研究

通过多种光谱方法与分子对接技术,从分子水平上对两种荧光增白剂(C.I.135、C.I.185)与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制进行研究。稳态荧光光谱及紫外-可见光谱实验结果表明,C.I.135、C.I.185与HSA均形成了基态复合物(HSA-C.I.135、HSA-C.I.185),猝灭机理为静态猝灭机理,热力学参数表明氢键与范德华力是结合作用的主要作用力,并且结合过程都是自发进行。三维荧光光谱结果表明C.I.135、C.I.185可以改变HSA的氨基酸残基微环境和构象,C.I.185对HSA产生的影响是最大的。分子模拟实验进一步验证上述实验结果。

表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定

报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和mCherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和mCherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。

基于P32蛋白的山羊痘病毒抗体荧光微球检测方法的建立

为建立一种山羊痘病毒(GTPV)抗体快速检测方法,试验将携带GTPV结构蛋白P32基因的重组质粒pET28a-P32转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导后获得了重组蛋白,纯化后经Western blot鉴定表明该蛋白具有良好的特异性和反应原性。以荧光微球为标记材料对P32蛋白进行标记,通过优化反应条件制备了快速检测GTPV抗体的荧光微球免疫层析试纸条,并对其性能进行评价。结果:该试纸条与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、羊口疮病毒(ORFV)的阳性血清均无交叉反应;阳性血清稀释至800倍仍能检出阳性,敏感性较高;批内变异系数小于10%,批间变异系数小于15%,稳定性较好;与ELISA检测方法对比的总符合率为92.5%。综上,本试验建立的荧光微球试纸条可用于GTPV抗体的快速检测和流行病学调查。

一种诱导表达绿色荧光蛋白穿梭质粒的构建及其在荧光示踪中的应用

细菌的荧光标记是一种重要的常用实验标记技术,用于研究细菌生理生化特性、感染宿主体内示踪、感染细胞示踪等研究。细菌的荧光标记通常通过质粒表达荧光蛋白来实现,而不同类型的细菌,由于菌种特性不同,构建的质粒往往不能通用。本研究构建了一种可诱导表达增强型绿色荧光蛋白的穿梭质粒pBT-iEGFP,该质粒可通过添加无水四环素诱导表达绿色荧光蛋白。诱导表达和传代稳定性试验表明,pBT-iEGFP质粒可在禽致病性大肠杆菌、鼠伤寒沙门菌和马耳他布鲁菌中成功诱导表达绿色荧光蛋白,在五代盲传中该质粒能在细菌中稳定遗传。胞内布鲁菌诱导表达试验证实,pBT-iEGFP质粒可成功示踪细胞感染过程中活的布鲁菌。总之,本研究构建的pBT-iEGFP质粒可作为细菌的荧光示踪研究工具,应用于多种实验研究。

荧光法测定四种肾上腺素药物与牛血清白蛋白的相互作用

运用荧光光谱法研究生理pH条件下四种肾上腺素药物与牛血清白蛋白(BSA)在不同温度下的相互作用。固定BSA浓度,梯度变化药物浓度,混合溶液分别在25℃及37℃水浴中温浴2h后进行荧光强度测定,运用Stern-Volmer方程及改进的双对数方程求出不同温度下药物与BSA的结合常数(K)和结合位点数(n)。结果表明,四种肾上腺素药物均与BSA形成结合物,对BSA荧光猝灭机制均为静态猝灭;不同温度下与BSA的K值顺序为硫酸沙丁胺醇>重酒石酸去甲肾上腺素>酒石酸美托洛尔>盐酸肾上腺素,37℃时的结合常数(K)和结合位点数(n)均大于25℃时的结果;热力学参数表明四种肾上腺素药物与BSA之间的结合均为自发过程,与BSA分子间主要作用力类型为疏水作用力。分子对接结果和实验结果符合较好。

脑心肌炎增强型绿色荧光蛋白嵌合病毒的构建

携带增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)的脑心肌炎(Encephalomyocarditis virus, EMCV)嵌合病毒是研究该病毒体内外生物学特性的有力工具。因此,本研究基于前期构建的巨细胞病毒(Cytomegalovirus, CMV)感染性克隆,在EMCV基因组2A蛋白序列之后插入EGFP基因片段,并将重组质粒转染BHK-21细胞,获得携带EGFP的嵌合病毒。通过荧光定量PCR(real-time PCR)、间接免疫荧光(Indirect immunofluorescence assay, IFA)及半数组织细胞感染量测定(Median tissue culture infective dose, TCID50)等方法对拯救病毒的基因组复制、蛋白表达及病毒粒子的感染性进行测定,结果证实嵌合病毒能够在BHK-21细胞上成功表达EGFP并产生完整的病毒粒子。然而,相较于野生型亲本拯救病毒,嵌合病毒在BHK-21细胞上的复制能力降低,并且在连续传代后逐渐失去绿色荧光信号,表明嵌合病毒中EGFP基因的插入对EMCV病毒粒子的组装释放具有不良影响,并在传代过程中逐渐累积导致EGFP功能丧失的缺失和突变。

利用绿色荧光蛋白优化辣椒遗传转化体系

【目的】农杆菌介导的辣椒遗传转化较为困难,至今仍未建立高效转化体系。绿色荧光蛋白(GFP)基因是植物遗传转化中常用的报告基因,以GFP为报告基因,优化农杆菌介导的辣椒遗传转化体系。【方法】利用GFP表达系统,统计3个辣椒品种(‘HP’‘8214’和‘L55’)中3种不同外植体(子叶、下胚轴和Flamingo-bill外植体)的不定芽分化率、不定根分化率与荧光阳性率,探究农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养时间和共培养时间等因素对不定芽、不定根分化率及荧光阳性率的影响。【结果】3个辣椒品种的Flamingo-bill外植体不定芽分化率均显著高于下胚轴与子叶外植体,其中‘L55’Flamingo-bill外植体的不定芽分化率最高、达77.59%,故选用‘L55’Flamingo-bill外植体进行后续研究。4种农杆菌不同侵染浓度和时间组合下,‘L55’Flamingo-bill外植体均可产生不定芽、不定根及表达GFP的愈伤组织,当农杆菌侵染浓度为OD_(600)=0.05,侵染时间为30 min时,不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.39%、4.84%。在6种不同预培养与共培养时间组合处理下,Flamingo-bill外植体也均产生不定芽和不定根,预培养1 d、共培养1~2 d处理下的不定芽分化率和荧光阳性率最高,分别达48.44%、12.50%。最后对表达GFP荧光的不定根与愈伤组织进行PCR检测,结果显示GFP、Kan和Cas9基因在荧光阳性的组织中均被检测到,表明农杆菌介导的T-DNA插入成功且转化稳定。【结论】辣椒的外植体类型、农杆菌侵染浓度、侵染时间、预培养和共培养时间均对辣椒遗传转化效率有影响。以GFP为报告基因,筛选合适的转化条件可提高农杆菌介导的辣椒遗传转化效率。

表达增强型绿色荧光蛋白的C型禽偏肺病毒反向遗传系统的构建及优化

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入C型aMPV(aMPV/C)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、CMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/C基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PCR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/C的迷你基因组(pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/C迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TCID 50/mL。而pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/C和pc-aMPV/C两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而CMV和T7作为aMPV/C RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/C RGS的构建,本研究为aMPV/C RGS的构建提供了多种方法。

新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A的应用研究

目的探讨新型量子点荧光免疫层析法测定血清淀粉样蛋白A(SAA)的应用。方法采用双抗夹心法结合量子点荧光免疫层析技术制备以二硝基苯酚(DNP)-牛血清白蛋白(BSA)系统为质控线的SAA检测试剂盒。通过鸡IgY-羊抗鸡IgY系统作为对照评价了DNP-BSA系统作为质控线的可行性,并通过优化量子点微球与抗体的偶联条件,进一步提高试剂盒的性能,并对试剂盒的空白限、检出限、线性范围、精密度、准确度、特异度、稳定性,以及临床实际样本测定等方面进行了评价。结果以DNP-BSA系统作为质控线的SAA试剂盒受干扰成分浓度的影响小,稳定性高,热稳定性好。量子点微球与SAA抗体偶联比例为100μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L 3-吗啉丙磺酸pH 7.4,与DNP-BSA偶联比例为100μg/mg,偶联反应液浓度为25 mmol/L吗啉乙磺酸pH 6.0时偶联效果最佳。试剂盒最低检出限为0.5 mg/L;线性范围为1~200 mg/L,R2≥0.99;批内精密度变异系数(CV%)≤5.31%,批间精密度CV%≤15%;在低、高浓度的回收率分别为101.42%、98.83%;在血红蛋白浓度≤5 g/L,胆红素浓度≤0.15 g/L,胆固醇浓度≤15 g/L,甘油三酯浓度10 g/L时,SAA的检测结果无干扰;试剂盒在50℃放置21 d,稳定性良好;试剂盒与Roche的SAA电化学发光试剂盒同步检测67例样本结果具有高度一致性。结论研制的SAA检测试剂盒灵敏度、线性、精密度、准确度、特异度及加速稳定性都满足试剂盒的要求,与鸡IgY-羊抗鸡IgY系统相比DNP-BSA系统作为质控线独立性好,测定临床样本准确度和热稳定性更佳。

两亲荧光芘衍生物与牛血清白蛋白的相互作用

为了获得水溶性芘衍生物与血清白蛋白的结合特性,研究了两亲芘衍生物(C_(12)PDA)与牛血清白蛋白(BSA)在中性缓冲溶液中的相互作用。首先,通过吸收和荧光光谱研究了C_(12)PDA与BSA的相互作用。结果表明,C_(12)PDA对BSA的荧光猝灭属于静态猝灭,疏水作用是两者之间的主要作用力。进一步利用同步荧光、三维荧光、圆二色光谱及分子对接模拟计算方法,研究了C_(12)PDA对BSA构象的影响以及结合方式。结果表明,C_(12)PDA与BSA的多个氨酸残基存在分子间氢键等相互作用,C_(12)PDA使BSA的α-螺旋结构含量减少。

荧光探针在蛋白磷酸化和糖基化检测中的应用

蛋白质翻译后修饰在细胞内起着关键的调控作用,对细胞的功能和代谢具有重要影响。近年来,荧光探针在研究蛋白质翻译后修饰中的应用不断发展。该文重点介绍了荧光探针在蛋白磷酸化和糖基化等修饰中的应用,包括其原理、设计策略以及在细胞和生物体内的应用。荧光探针的发展为研究蛋白质翻译后修饰提供了强有力的工具,有望深化对这些修饰过程的理解,并为药物研发和疾病诊断提供新的途径。

蛋白质的非定点荧光标记——推荐一个化学生物学实验

本论文介绍了一项化学生物学实验,旨在利用异硫氰酸荧光素的异硫氰基与蛋白质氨基共价结合的原理,实现对体外蛋白(以牛血清白蛋白为例)和体内蛋白(以大肠杆菌总蛋白为例)的非定点荧光标记。实验采用凝胶过滤法作为后续纯化手段,并运用紫外-可见分光光度计、流式细胞术以及荧光显微镜对标记结果进行全面表征。该实验涵盖了多种基础和前沿实验技能,与科研工作中常见的抗体荧光标记技术密切相关,难度适中。通过参与这一实验,学生不仅能够深入理解化学生物学基础知识,提高综合实践能力,还能够拓宽科研视野并培养科研思维。

基于荧光光谱法研究酪蛋白与茶黄素类的相互作用

蛋白质和茶多酚是常见的互作体系,本项目旨在通过荧光光谱法研究酪蛋白和茶黄素类的相互作用,并通过不同温度下模型拟合确定其互作机制。结果表明,茶黄素类能够猝灭酪蛋白的自身荧光,猝灭类型为静态猝灭。当茶黄素类浓度为0.028 mg/mL时,在29℃、37℃和45℃温度下,酪蛋白的荧光强度分别下降了66.7%、55.6%、52.2%,且最大发射波长有轻微红移现象。在不同的温度下,酪蛋白均可自发地与茶黄素类结合,结合位点数约为1,结合方式主要以氢键和范德华力为主导。研究结果可为酪蛋白-茶黄素类复合物在功能食品中的应用提供参考。

pH荧光分子探针与人血清白蛋白之间相互作用的研究

在模拟生理条件下,用光谱法研究了pH荧光探针WZK-33与人血清白蛋白(HSA)的相互作用机制。由光谱谱图结果可以得出,此探针可以猝灭HSA的荧光,探针与HSA之间的猝灭机制主要是静态猝灭方式。由热力学数据确定了二者之间的作用力类型为范德华力和氢键,结合位点为一个。二者之间的结合距离为4.77 nm。同步荧光、三维荧光光谱以及CD光谱表明探针改变了HSA的构象。

5-羟甲基糠醛与胃蛋白酶相互作用的荧光光谱研究以及分子模拟分析

目的:采用荧光光谱法和分子对接模拟分析5-羟甲基糠醛(5-HMF)与胃蛋白酶的相互作用及分子结构特征。方法:应用荧光分光光度计,通过荧光淬灭分析、同步荧光分析、三维荧光分析、疏水探针分析,获得5-HMF与胃蛋白酶相互作用的光谱学信息;通过分子对接模拟分析,揭示5-HMF与胃蛋白酶结合的具体位点及互作信息。结果:5-HMF通过单一静态猝灭机制,导致胃蛋白酶分子荧光淬灭。吉布斯自由能△G为负值,表明二者结合为自发反应,同时熵变△H和焓变△S也均为负值,表明氢键和范德华力是维持5-HMF与胃蛋白酶相互作用的主要作用力。同步荧光分析表明,5-HMF能够影响了胃蛋白酶分子中Trp残基的微环境。三维荧光分析结果表明,5-HMF改变了胃蛋白酶的空间结构、氨基酸残基的微环境以及荧光发射峰强度。分子对接模拟分析结果显示,5-HMF分子中羟基可与胃蛋白酶分子中的Ile 100和Ans 37形成氢键,其杂环可与Leu 38、Pro 135和Ala 133产生疏水作用,整个分子还会与Phe 101、Val 136、Ser 129、Gly 102形成范德华力。结论:5-HMF能够与胃蛋白酶相互作用结合,导致胃蛋白酶分子结构及光谱特性发生改变。

蛋白质残留检测法与ATP生物荧光检测法在机洗后软式内镜清洗质量监测结果不一致原因分析

目的探究蛋白质残留检测法、ATP生物荧光检测法在机洗后软式内镜清洗质量监测结果不一致的原因。方法选取该院内镜中心2023年1—7月处于使用状态的胃镜、肠镜标本15份作为监测对象,经自动清洗消毒机清洗后,分别用蛋白质残留检测法、ATP生物荧光检测法进行清洗消毒质量监测,并比较检测结果。结果蛋白质残留检测法阳性率(14/15)高于ATP生物荧光检测法不合格率(1/15)。结论麦迪威特牌(型号DSD-201)全自动内窥镜清洗消毒机进行内镜清洗消毒程序时,在使用过氧乙酸消毒剂的情况下,蛋白质残留检测结果阳性不代表软式内镜清洗质量不合格,而是过氧乙酸作为氧化性的消毒剂造成的假阳性结果。

基于蛋白质保留膨胀显微镜对微囊泡进行荧光成像的实验研究

目的:探讨蛋白质保留膨胀显微镜(proExM)与小鼠下颌骨来源微囊泡(MVs)的相容性,观察膨胀后MVs表面标志物的分布情况并精确识别其细胞来源。方法:采用差速离心法分离小鼠下颌骨来源MVs;利用透射电子显微镜、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术对MVs进行观察鉴定;对MVs表面蛋白CD9、CD63、碱性磷酸酶(ALP)、破骨细胞相关受体(OSCAR)进行免疫荧光染色;采用proExM技术对免疫荧光染色后的MVs进行膨胀放大;测量膨胀系数并利用激光共聚焦显微镜观察膨胀前后MVs的形态以及荧光染色情况。结果:差速离心法分离得到的小鼠下颌骨来源MVs符合MVs鉴定标准;在该实验流程下,通过凝胶的膨胀实现小鼠下颌骨来源MVs的4倍膨胀;膨胀后MVs线剖面上CD9、CD63的荧光强度分布呈现多峰;相较于膨胀前,膨胀后MVs表面标志物CD9、CD63的曼德斯共定位系数(MCC)1方差变大(P<0.01),MCC2方差变小(P<0.05),皮尔森相关系数(PCC)方差变大(P<0.01);膨胀后实现对成骨细胞分泌的MVs以及破骨细胞分泌的MVs的精准识别;膨胀后测得小鼠下颌骨来源CD9+MVs中,成骨细胞来源MVs占比11.11%,破骨细胞来源MVs占比3.70%。结论:该实验流程可在小鼠下颌骨来源MVs的观测中提高分辨率,为揭示MVs表面蛋白分布的异质性,精准识别组织MVs的细胞来源建立一种标准实验流程。