mHSP70分子中免疫刺激肽段与CD40对接复合物的结构模拟

微生物体内的70 ku热休克蛋白407-426片段可以有效刺激体内CD40+抗原递呈细胞如DC,单核细胞等的成熟,可有效刺激体内产生IL12和TNFα,被认为是CD40L的替代配体,因此对免疫系统有着重要的意义。同时,该片段还可以有效结合外源蛋白分子,因此又是天然的递呈抗原的载体佐剂。该文章以开发新型载体佐剂为目的,使用Discovery studio软件分析经过单片段与两次串联的该肽段结构并预测了它们与CD40分子进行对接后的复合物。经过分析其关键结合位点,阐明了该肽段与CD40分子间参与相互作用的残基,并发现经过2次串联的肽段确实可以比单片段更有效的与CD40进行相互作用。因此,实验结果可为新型肿瘤疫苗的设计提供理论依据。

真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-M2的构建及在小鼠骨髓树突状细胞中的表达

为了构建含有绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)报告基因的M2真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-M2(2段热休克蛋白70表位序列407-426,mHSP70407-426,M2),探讨M2基因转染小鼠骨髓树突状细胞(Dendritic cell,DC)的表达情况。采用4轮PCR方法从pcDNA3.1(+)-GFP载体中将GFP编码序列扩增出来,并在其上游引入Kozak序列,下游引入M2序列,使用限制性内切酶HindIII和BamHI将目的片段插入到pcDNA3.1(+)中,利用质粒自带的氨苄青霉素抗性筛选出阳性克隆,获得重组基因的表达载体。重组载体通过转染试剂Lipofectamine2 000转染至DC中,通过倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在细胞内的表达。构建的pcDNA3.1(+)-GFP-M2经双酶切、PCR和测序鉴定和预期结果一致。荧光显微镜观察显示在转染pcDNA3.1(+)-GFP-M2基因的树突状细胞中,荧光均匀地分布于整个细胞。成功构建含有绿色荧光蛋白报告基因的M2真核表达载体pcDNA3.1(+)-GFP-M2。M2基因成功转染至树突状细胞中。

口蹄疫病毒A-O型多表位二价融合抗原的构建及其在小鼠模型中的免疫学功能

为了研制广谱高效的新型口蹄疫病毒(FMDV) A-O型重组多表位二价疫苗,以结核分支杆菌热休克蛋白70(mHSP70)的C端肽结合区作为多表位免疫原的载体蛋白,将A型和O型FMDV代表性毒株VP1上的B细胞表位以及非结构蛋白3A上的T细胞表位基因进行串联合成后与mHSP70的肽结合区编码基因相连接,构建重组质粒pAO-HSP,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。重组蛋白经过纯化和鉴定后免疫BALB/c小鼠,检测相应的体液免疫应答和细胞免疫应答。结果显示:重组蛋白pAO-HSP在BL21(DE3)中能够以可溶性形式表达,纯化后经Western blot检测能够与感染了A型和O型FMDV猪的阳性血清发生特异性反应,并能够刺激小鼠产生抗A-O型FMDV特异性抗体。免疫后小鼠的脾淋巴细胞在A型、O型灭活FMDV刺激后,均出现显著的增殖现象,同时可以产生相关的Th1或Th2型细胞因子。本研究成功构建重组抗原pAO-HSP,并在小鼠模型中初步显示出了良好的免疫效果,为新型FMDV A-O型多表位二价疫苗的研发奠定基础。