表达mIFN-γ的重组链球菌的构建及其对重组Sj-F1链球菌疫苗免疫调节作用研究

目的构建表达mIFN-γ的重组链球菌,并与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗进行联合免疫,观察IFN-γ对重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗的免疫调节效应。方法用PCR法扩增mIFN-γ基因,亚克隆至链球菌重组质粒pGMB1,经PCR、限制性酶切和测序鉴定筛选阳性重组子。将阳性重组质粒转化链球菌载体,经抗生素抗性转化及染色体PCR鉴定筛选阳性重组链球菌。用Streak blot和Western blot分析鉴定重组链球菌的表达情况。鉴定后的重组mIFN-γ链球菌与重组Sj-F1链球菌疫苗联合应用,经滴鼻接种免疫昆明小鼠,观察诱导产生的减虫和减卵效果。结果成功构建了分泌mIFN-γ重组链球菌。Streak blot和Western blot分析表明重组链球菌能分泌mIFN-γ并可稳定遗传。免疫保护性实验表明,重组mIFN-γ链球菌与重组日本血吸虫Sj-F1链球菌疫苗联合免疫,减虫率和减卵率分别为31.56%和47.48%,与单用重组Sj-F1链球菌疫苗比较减虫率和减卵率圴增加。结论结果表明,重组mIFN-γ链球菌能增强重组Sj-F1链球菌疫苗抗日本血吸虫感染的保护力。

装载mIFN-γ基因的溶瘤腺病毒CNHK200的抗肝癌活性

目的:研究鼠源γ-干扰素(mIFN-γ)基因插入溶瘤腺病毒CNHK200后,该病毒对不同的肝癌细胞系及其裸鼠移植瘤的增殖力及特异性杀伤作用。方法:用MTT法检测CNHK200-mIFN-γ在体外对人正常肝细胞L02、人肝癌细胞Hep3B、HepGⅡ的特异性杀伤作用;裸鼠体内试验观察CNHK200-mIFN-γ对肝癌Hep3B模型的抗肿瘤疗效。结果:CNHK200-mIFN-γ对正常人肝细胞L02无杀伤作用,但能特异性杀伤肝癌细胞,mIFN-γ的插入使病毒对肿瘤细胞的杀伤能力提高;动物体内,CNHK200-mIFN-γ具有明显的肿瘤生长抑制作用。结论:CNHK200-mIFN-γ可以高效率地杀死肝癌肿瘤细胞,而不杀伤正常细胞,可能具有良好的临床应用前景。

特异性增殖型腺病毒CNHK300-mIFN-γ治疗胃癌的体外实验研究

目的研究增殖型腺病毒CNHK300-mIFN-γ在胃癌细胞BGC．823中的特异性增殖能力、目的基因表达能力、肿瘤杀伤作用及安全性。方法通过增殖实验比较CNHK300-mIFN-γ与CNHK300在胃癌细胞BGC-823与成纤维细胞BJ中的增殖能力；ELISA法检测CNHK300-mIFN-γ和复制缺陷型腺病毒Ad-mIFN-γ不同细胞中mIFN-γ蛋白的表达量；MTT与细胞病变效应（CPE）实验观察CNHK300-mIFN-γ对胃癌细胞的杀伤效应及安全性。结果增殖实验结果表明CNI-IK300-mIFN-γ能选择性地在端粒酶阳性的胃癌细胞中大量增殖；ELISA实验结果表明CNHK300-mIFN-γ在胃癌细胞BCG-823中mIFN-γ的表达量可至（171．93±33．61）ng／ml，表达量高于复制缺陷型腺病毒Ad-mIFN-γ【（0．92±0．24）ng／ml]；MTT与CPE实验表明CNHK300-mIFN-γ对胃癌细胞BGC．823有较强的杀伤作用，对正常细胞并无明显杀伤。结论增殖型腺病毒CNHK300-mIFN-γ感染胃癌细胞BGC-823后能高效增殖并大量表达mIFN-γ蛋白，对胃癌细胞有明显杀伤作用且安全性良好。

腺病毒介导mIFN-β基因转染的小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性

目的 研究腺病毒 (Ad)介导mIFN β基因转染的B16小鼠黑色素瘤细胞的体外生物学特性。方法 用Ad为载体将mIFN β基因导入B16细胞 ,观察mIFN β基因转染的B16细胞的体外增殖能力及免疫原性的改变。结果 当MOI为 5 0～ 10 0 ,即可获得较高的转染效率 ,达 90 %± 1% ,转染细胞能表达分泌mIFN β并具有生物学活性 ;AdmIFN β感染对B16细胞的增殖能力无影响 ,但能显著提高细胞表面MHC Ⅰ类抗原的表达。结论 Ad载体具有较高的转移效率 ,并能使其携带的mIFN β基因有效表达 ;AdmIFN β转染的B16细胞的免疫原性显著增强。提示利用Ad载体携带有效的目的基因来治疗肿瘤甚至开发瘤苗是可行的。

复制缺陷型重组腺病毒介导mIFN-β基因治疗小鼠黑色素瘤的作用研究

目的 观察体外转mIFN β基因的B16细胞的体内致瘤性和瘤苗作用 ,及通过腺病毒载体介导的mIFN β对体内局部肿瘤治疗和抗肿瘤转移的作用 ,并对其机制进行探讨。方法 利用人类复制缺陷型重组腺病毒将目的基因mIFN β经体外、体内两种途径导入小鼠黑色素瘤细胞 (B16细胞 )中。结果 ①携带目的基因的重组腺病毒感染B16细胞能获得较高的转移效率和目的基因的有效表达 ;②将mIFN β基因导入B16细胞对B16细胞的体外增殖能力无明显影响 ,但能显著提高细胞表面MHC Ⅰ类抗原的表达 ;③将转mIFN β基因的B16细胞接种小鼠 ,其体内致瘤性明显降低 ,且对野生型B16细胞的致瘤性有抑制作用 ;④瘤体内注射和经尾静脉注射途径给予AdCMVmIFN β ,对局部肿瘤和转移瘤有治疗作用。该结果提示 ,利用腺病毒载体携带有效的目的基因来开发瘤苗和治疗肿瘤具有良好的临床应用前景。

小鼠干扰素-γ基因克隆及其腺病毒载体的构建

目的构建含有小鼠干扰素-γ(mIFN-γ)基因的腺病毒载体,为探索IFN-γ在肝纤维化治疗中的作用研究奠定基础。方法从含有mIFN-γ基因的质粒载体pORF5-mIFN-γ中PCR扩增出mIFN-γ基因片段,双酶切将该基因克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV中,限制性内切酶PmeⅠ线性化pAdTrack-CMV-mIFN-γ,转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的大肠杆菌株BJ5183细胞,同源重组。卡那霉素及酶切筛选出重组子pAd-mIFN-γ,内切酶PacⅠ线性化重组子,用磷酸钙法转染细胞株AD-293进行包装,收集病毒进行鉴定。结果 PCR后测序获得mIFN-γ基因,全长468 bp,与GenBank中发表的mIFN-γ基因核苷酸序列完全一致。经酶切和PCR证实各中间过程载体均含有目的基因。包装的病毒Ad-mIFN-γ在转染的4～6 d观察到荧光产生,8～11 d荧光逐渐增加,12 d收集病毒液。蛋白酶K裂解重组腺病毒,经PCR和Western blot方法鉴定,证实携带有目的基因mIFN-γ。结论大肠杆菌内同源重组法能有效和较为方便地构建出含有目的基因的腺病毒载体pAd-mIFN-γ,重组子能够在AD-293细胞中进行包装和扩增,病毒包装的成功为进一步研究mIFN-γ基因治疗小鼠肝纤维化提供了一个良好的转导载体。

Sj31与鼠IFN-γ基因融合DNA疫苗免疫保护效果的研究

目的构建表达mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗,并探讨其免疫保护作用。方法在Sj31基因上游引物与mIFN-γ下游引物的5’分别设计与克隆载体相匹配的酶切位点,在mIFN-γ上游引物与Sj31基因下游引物的5’设计相同的酶切位点。分别进行PCR扩增,再通过引物的5’端相同的酶切位点进行2个PCR产物的酶切与连接,以连接产物为模板,应用Sj31的上游引物和mIFN-γ下游引物进行PCR扩增,将此次PCR产物经常规方法克隆入载体pcDNA3.0(简称为pc),构建成多价DNA疫苗pc-Sj31-mIFN-γ。对重组质粒鉴定后,大量制备纯化质粒免疫昆明小鼠,48只小鼠分为A、B、C、D4组,对照组的小鼠于股四头肌注射质粒pcDNA3.0100μg,3个免疫组的小鼠分别注射pc-Sj31、pc-mIFN-γ和pc-Sj31-mIFN-γ质粒DNA各100μg。在0、2、6周免疫共3次,第3次免疫后2周,每只小鼠经腹部贴片感染尾蚴40±1条,感染后第42天剖杀,计数各小鼠检获成虫数及肝卵数。结果pc-Sj31-mIFN-γ(D组)免疫组的减虫率和肝组织减卵率分别为28.56%和60.20%,但是表达鼠mIFN-γ与Sj31抗原融合蛋白的DNA疫苗并未明显优于单纯表达日本血吸虫组织蛋白酶B(Sj31)DNA疫苗的免疫保护作用。结论pc-Sj31-mIFN-γ多价DNA疫苗构建成功,但其诱导小鼠抗血吸虫病免疫保护效果不明显优于pc-Sj31。

小鼠IFN-γ真核表达质粒的构建及表达

目的构建重组小鼠干扰素γ(mIFN-γ)真核表达系统,并检测其在cos-7细胞中的表达。方法用RTPCR方法,从ConA活化的小鼠脾细胞中扩增出mIFNγcDNA,将其克隆至pGEMT载体上,测序正确后,再定向连接到真核表达载体pcDNA3中,经DEAEDextran转染至cos7细胞,检测其在细胞内外的表达。结果RTPCR扩增的mIFNγcDNA与GenBank中mIFNγ序列一致。构建的真核重组表达质粒pcDNA3/mIFNγ转染cos7细胞后,可检测到mIFN-γ的转录和表达。结论已成功构建了mIFNγ真核表达系统,为抗病毒基因疫苗的研究奠定了基础。

鼠白介素28重组腺病毒感染小鼠后的表达

目的:观察鼠白介素28重组腺病毒(r-Ad-mIFN-λ2)感染小鼠后的表达。方法:将已成功构建的重组腺病毒r-Ad-mIFN-λ2感染小鼠,采用实时PCR、蛋白质印迹方法,检测小鼠骨骼肌mIFN-λ2基因和蛋白的表达,并监测小鼠的生长情况。结果:重组腺病毒Ad-mIFN-λ2在小鼠体内能够稳定表达,且不影响其正常生长。实时PCR结果显示Ad-mIFN-λ2组持续表达mIFN-λ2 mRNA,表达量高于空白组和空载体LacZ组;蛋白质印迹结果表明Ad-mIFN-λ2组出现明显mIFN-λ2蛋白的条带,空白组及LacZ组条带较淡;监测小鼠体质量表明感染r-Ad-mIFN-λ2的小鼠能够正常生长,与空白组和LacZ组之间差异无统计学意义。结论:构建的重组腺病毒Ad-mIFN-λ2在小鼠体内感染后能够稳定表达,且不影响其正常生长,为进一步研究mIFN-λ2在动物体内的生物学活性奠定了一定的基础。

鼠IFN—λ2 CHO细胞系建立及生物学活性的研究

目的稳定表达鼠IFN—λ2并对其生物学活性进行研究。方法用水疱口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）刺激小鼠脾脏细胞，克隆mIFN—λ2全长基因，构建真核表达载体PCAGG-EGFP-mIFN-λ2，并在CHO细胞稳定表达，且在小鼠黑色素瘤B16细胞上进行抗病毒活性测定；构建MDBK-Mxp—Luc细胞系诱导Mx1抗病毒蛋白产生。结果pMD18-T-mIFN—λ2双酶切鉴定，出现582bp大小的条带，成功构建了PCAGG—EGFP—mIFN—λ2真核表达载体；稳定表达mIFN—λ2 CHO的细胞株分泌的上清中mIFN-λ2蛋白在B16细胞上的抗病毒活性为10^4AU／ml；mIFN-λ2蛋白诱导鼠Mx1抗病毒蛋白的表达，9～12h达高峰，24h后消失（P〈0．05）。结论建立了稳定表达mIFN—λ2的CHO细胞株，其分泌型mIFN—λ2蛋白具有明显的抗病毒活性。