mRNA差异展示研究胃癌差异表达基因

以胃癌细胞株GC790 1与胃粘膜细胞株GES 1为对比材料 ,利用mRNA差异展示技术 ,研究胃粘膜至胃癌过程的差异表达基因 ,为建立胃癌预警系统打下基础 .获得 8个未知的与胃癌相关的cDNA ,命名为GCYS 1,2 ,3,4,5 ,6 ,7,2 0 ,完成其克隆及序列分析 ,RNA印迹证实GCYS 1至 7片段与GCYS 2 0基因在GC790 1细胞株中呈高表达 ,在GES 1细胞株中呈低表达 .此 8个序列在GenBank数据库中登录 ,接受号为AF0 5 416 2～AF0 5 6 16 8及AF2 19140 .

mRNA差异显示研究胃癌相关基因

为了克隆与胃癌发病相关的新基因，我们以正常胃粘膜细胞ＧＥＳ和胃癌细胞系７９０１为对比材料，利用ｍＲＮＡ差异显示技术，得到两个ｃＤＮＡ片段。经分析发现，分别与Ｔｒｋ基因及白血病病毒基因有８０％和３０％的同源性及较好的读框，有可能为胃癌相关的新基因片段，已在ＧｅｎＢａｎｋ中登录：１７６１１６，１７６３８５。

mRNA差别显示研究肝再生调控基因

以正常肝和再生肝为对比材料 ,利用mRNA差别显示技术 ,研究肝再生过程中基因的差别表达 ,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理 .得到 4种未知肝再生相关cDNA ,完成其克隆与序列分析 ,一例在再生肝中的表达低于正常肝 ,余者则高于正常肝 .这些序列均已在EMBL(EuropeMolecularBiologyLaboratory)数据库中登录 ,登录号分别为X9572 1、X9572 2、X9572 3、X97973.

mRNA差别显示技术对肝再生调控基因的研究

以正常肝和再生肝为对比材料,利用mRNA差别显示技术,研究肝再生过程中基因的差别表达,旨在从基因选择性表达水平上探讨肝再生调控机理。得到4种未知肝再生相关cDNA,完成其克隆与序列分析,其一在再生肝中的表达低于正常肝,余者则高于正常肝。这些序列均已在EMBL(Europe Molecular Biology Laboratory)数据库中登录,登录号分别为X95721、X95722、X95723、X97973。

Screening of Novel Epilepsy-Related Genes and Isolation and Identification of cDNAs

Summary: Twenty cDNA differential fragments were isolated from the hippocampus of rats in epileptic state. using mRNA differential display technique. Four fragments were sequenced and compared with the known sequences in the Genebank, which showed that ERGS, ERG12, ERG12 had no significant identity to any known sequences; ERG14 had 64 %-69 % identity to micro- tubulin-associated protein of the rat. Because the differential expression of these genes was caused by epilepsy inducer coriaria lactone (CL) and anti-epilepsy drug MK-801 and ERGS might be a novel candidate epilepsy gene; ERG11 and ERG12 might be novel candidate anti-epilepsy genes. Since the microtubulin-associated protein is closely associated with the collateral sprouting of mossy.fibers in the hippocampus of seizured rat, the high expression of ERG14 in the early stage of epilepsy might predict the growth of axon and formation of synapse.

鸡MDA5的序列分析与结构域预测

为了解鸡黑色素瘤分化相关基因-5(Melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5)的序列和结构域,试验使用PCR方法扩增了鸡MDA5基因并构建真核表达质粒,实现了鸡MDA5蛋白的真核表达,同时利用MegAlign等软件对鸡MDA5氨基酸序列进行分析。结果显示:鸡MDA5全长3 006 bp,编码1 001个氨基酸;鸡MDA5与人、猕猴、野猪、小鼠、绿头鸭、灰雁、鸿雁、鲫鱼、草鱼的氨基酸相似性分别为62.4%、62.9%、62.7%、64.1%、86.8%、87.3%、87.4%、48.1%、46.3%;鸡MDA5与鸟类进化关系较近,与哺乳动物次之,与鱼类进化关系较远;鸡MDA5由N端两个半胱天冬酶激活招募结构域、DExD/H box RNA解旋酶结构域和C端结构域组成;鸡MDA5二级结构包含α螺旋(50.95%)、延伸链(11.19%)、β转角(3.9%)和无规则卷曲(33.97%),三级结构与人MDA5类似,在空间上呈现半闭合环状结构。研究成功鉴定了鸡MDA5基因,分析了其基因序列并预测其结构域,为深入研究鸡MDA5结构与功能及其在鸡抗病毒天然免疫应答中的作用奠定基础。

猪MyD88基因的克隆及组织表达谱分析

本研究旨在克隆猪MyD88的基因序列,并研究其在不同组织中的表达差异。利用RT-PCR技术从猪肠系膜淋巴结组织总RNA中克隆出猪MyD88的cDNA序列,用相关软件进行了基因结构和功能预测,并利用Real-time PCR技术对MyD88基因的组织表达谱进行了分析。序列分析结果表明克隆到的序列全长为897 bp(EF198416),其882 bp的开放阅读框编码的293个氨基酸残基组成猪髓样分化因子88(MyD88);推导的氨基酸序列分析显示:猪MyD88蛋白具有典型的死亡结构域和TIR结构域,相似性分析结果显示,MyD88在进化过程中具有高度保守性,与人、牛、褐鼠和小鼠的氨基酸序列相似性分别为88.4%、85.7%、78.8%和78.2%;Real-time PCR结果表明:MyD88在11个组织中的相对表达水平存在差异,其在派伊氏小体和肠系膜淋巴结中表达量相对较高,在心脏和肌肉组织中表达量较低。猪MyD88基因的克隆和表达研究为进一步研究其生物学功能奠定了基础。

人B组轮状病毒vp7基因的克隆和序列分析

利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增了人B组轮状病毒WH-2vp7基因,连接到克隆载体pUCm-T,并对其基因序列进行了分析。WH-2与ADRV的同源性达98％,与印度加尔各达分离株CAL-1达92％,而与动物B组轮状病毒同源性差别较大,如与IDIR(鼠)同源性仅为58％,与WD653(牛)B组轮状病毒同源性为63％,与ATI(牛)同源性为61％。对vp7基因的二级结构分析发现其mRNA折叠形成多达18个发卡环状结构。VP7蛋白是249个氨基酸组成,分子量为28.4kDa,含有3个潜在的N连接的糖基化位点和多个磷酰化位点,从氨基酸序列的同源性来看,WH-2与ADRV的同源性达99％,与CAL-1达95％,而IDIR仅为51％,说明了WH-2和ADRV的起源相同。此研究对了解B组轮状病毒基因的进化和变异规律具有重要意义,也将为B组轮状病毒预防性疫苗的研制提供科学的依据。

华东葡萄抗白粉病基因差异表达cDNA克隆与序列分析

为筛选和克隆华东葡萄抗白粉病相关基因,以高抗葡萄白粉病的华东葡萄株系白河-35-1为材料,采用mRNA差异显示(DDRT-PCR)技术进行在白粉病病原菌诱导下抗白粉病差异表达基因的研究,筛选出适宜DDRT-PCR的引物组合184对,获得抗白粉病差异表达的cDNA片段13个,序列分析结果显示其功能分别涉及转录调控、能量代谢、蛋白合成、防御反应等生理生化过程,表明华东葡萄白河-35-1抗白粉病是诸多代谢途径相互协调作用的结果。这些差异片段的获得为探明葡萄抗白粉病分子机制提供了前期理论基础。

中华蜜蜂mab-21基因序列分析及表达特征

【目的】探究中华蜜蜂Apis cerana cerana Male abnomal 21(mab-21)基因在不同发育阶段的表达特性及染螨条件下mab-21基因表达变化规律。【方法】本研究利用RT-PCR方法,克隆了中华蜜蜂mab-21的基因编码区;采用荧光定量PCR方法检测了中华蜜蜂mab-21在不同发育时期(新出房蜂、哺育蜂、守卫蜂及采集蜂)工蜂头部中mRNA的表达量以及接种大蜂螨Varroa destructor前后mab-21基因的表达变化。【结果】克隆获得中华蜜蜂mab-21c DNA,命名为Accmab21(Gen Bank登录号KR000001)。序列分析显示,该编码区开放阅读框长为1 098 bp,编码365个氨基酸,推测的编码蛋白的相对分子量和等电点分别为41.63 k D和8.53。系统发育分析表明中华蜜蜂mab-21与西方蜜蜂Apis mellifera mab-21、小蜜蜂Apis florea mab-21和熊蜂Bombus impatiens mab-21聚成一支。该基因在中华蜜蜂工蜂的不同发育时期均有表达,其中哺育蜂阶段显著高于新出房蜂、守卫蜂和采集蜂(P<0.05)。接种大蜂螨后,哺育蜂和守卫蜂中mab-21基因的表达下降显著(P<0.05);而在新出房蜂和采集蜂中表达量变化不显著。【结论】该基因可能与中华蜜蜂抗螨行为相关。

全雌系苦瓜ACC氧化酶基因cDNA克隆及序列分析

为研究1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶(ACC氧化酶,ACO)基因在苦瓜性别分化中的作用,以全雌系苦瓜‘X-Hei-d-d’花蕾为试材,采用RT-PCR和RACE技术获得了ACC氧化酶基因(Mc-ACO1)的全长cDNA序列。该序列为1 137 bp(GenBank登录号:FJ459813),其完整开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量为37.30 kD,肽链N端缺失ACOs家族典型的1个保守区和2个保守二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶氨基酸残基。序列分析表明,植物ACO基因的演化与其来源植物亲缘关系的一致性较高;与其他物种相比,苦瓜Mc-ACO1不同的氨基酸序列主要表现在肽链N端;苦瓜Mc-ACO1应属于黄瓜Cs-ACO2类成员,功能可能与性别分化相关。

鼠抗CD4抗体轻链及重链可变区基因的克隆和序列分析

为获得鼠抗人 T细胞分化抗原 4分子单抗的轻链及重链可变区基因。采用 RT- PCR技术 ,从 Wu T4细胞总RNA中扩增出轻链和重链可变区基因 ,进行克隆并作核苷酸序列分析 ,发现 RT- PCR扩增出来的两条轻链和一条重链可变区基因分别为 4 0 0 bp左右 ,构建的 p MD18T- VL 和 p MD18T- VH 重组克隆载体 ,酶切与预期结果相符。测序得到它们的 DNA序列。结果表明 ,克隆的两条轻链可变区基因序列一致 ,长度均为 32 4 bp,属于鼠轻链 亚类。克隆的重链可变区基因长度为 375 bp,属于鼠重链 (C)亚类。

人骨肉瘤差异表达基因的筛选

目的 研究人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的差异表达基因 ,探讨骨肉瘤的基因改变 ,为建立骨肉瘤的基因诊断方法打下基础 .方法 采用 m RNA差异展示技术 ,应用 3条锚定引物和 8条随机引物从人骨肉瘤组织与正常骨组织中分离出差异表达基因 ,对其进行克隆、测序 ,用打点杂交技术证实其是否为差异表达基因 ,将筛选出的差异表达基因在Gen Bank检索进行序列同源性分析 .结果 筛选及克隆出 6条差异条带 ,为 ZOL 0 3,ZOL 5 1,1C82 ,1C74,2 A2 1及 2 G12 ,RNA打点杂交证实它们在骨肉瘤中表达 ,在正常骨组织中不表达 . 6条差异片段经序列测定 ,在 Gen Bank数据库中进行序列相似性分析 ,证实 ZOL 0 3,ZOL 5 1同源性极低 ;1C82 ,1C74,2 A2 1,2 G12同源性较低 ,此 6条片段为新基因序列 ,ORF finder分析未发现具有开放读框 ,均属于非编码区序列 .其中 ZOL0 3和 ZOL5 1两个序列在 Gen Bank数据库中登录 ,接受号为 BI8942 76和 BI936 370 .结论 分离并克隆了人骨肉瘤组织与正常骨组织之间的 6条差异表达基因 ,同源性差 ,均确认为新基因 。

海带lhcf4基因克隆和配子体差异表达研究

根据糖海带(Laminaria saccharina)光捕获蛋白基因lhcf4的cDNA全长序列(GenBank登录号:AF226860)设计引物,通过RT-PCR方法获得海带(Saccharina japonica)配子体lhcf4基因的cDNA全长序列,共1 042 bp,编码一个含218个氨基酸的前体蛋白LHCF4,推测分子量为23.11 kDa,等电点为5.36。与其同源基因相似度分析表明,lhcf基因的开放阅读框(Open reading frame,ORF)在家族内及物种间高度保守,变异主要发生在非翻译区(Untranslated re-gion,UTR)。预测LHCF4成熟蛋白三级结构存在4个α螺旋区,其中第一、三螺旋较长,形成跨膜螺旋,第二个螺旋相对较短,完全镶嵌在膜中,另外一个为短螺旋,位于类囊体膜-类囊体腔界面上。杂色藻类、绿藻及豌豆光捕获蛋白氨基酸多序列比对显示叶绿素a结合位点及盐桥形成氨基酸残基在植物进化中高度保守;将预测的海带LHCF4蛋白3D结构与豌豆X-衍射晶体结构进行空间重叠,获得了结合在LHCF4蛋白上的5个叶绿素a的空间分布。Neighbor-joining分子进化树显示原绿球藻、绿藻和杂色藻类的光捕获蛋白基因是三个独立进化的系统,共同起源于蓝细菌的只结合叶绿素a的光捕获蛋白;海带lhcf4基因与糖海带lhcf4及巨藻的fcpb基因为直系同源;糖海带lhcf4、lhcf7及lhcF1基因为旁系同源。实时荧光定量PCR结果证实lhcf4基因具有雌、雄配子体差异表达特征。

中华蜜蜂dynactin p62基因的克隆及不同发育阶段表达分析

为探究中华蜜蜂Apis cerana cerana dynactin p62基因的表达特性,本研究克隆了中华蜜蜂dynactin p62的基因组DNA序列(GenBank登录号:JX101463)和mRNA序列(GenBank登录号:JX101464);采用荧光定量PCR检测了中华蜜蜂dynactin p62在不同发育时期(3日龄和6日龄幼虫、刚羽化出房蜜蜂)三型蜂中mRNA的表达量。结果表明:该基因基因组DNA序列全长为2403bp,mRNA序列全长为1491bp,编码496个氨基酸残基,预测的蛋白分子量为56.49kD,等电点为8.31。系统发育分析表明中华蜜蜂dynactin p62与西方蜜蜂Apis mellifera dynactin p62聚成一支。该基因在不同发育时期均有表达,在雌性蜜蜂(蜂王和工蜂)中,刚羽化成虫期的表达量显著高于幼虫期(P<0.05),并且同一发育时期相比,工蜂的表达量显著高于蜂王(P<0.05);而该基因在雄蜂中表达量没有明显的规律性。这些结果提示该基因可能与中华蜜蜂级型分化有关。

B组轮状病毒WH-1株NSP2基因序列和蛋白质结构分析

目的 克隆成人腹泻标本WH 1中B组轮状病毒组 (groupBrotavirus ,GBRV)非结构蛋白NSP2基因 ,分析其核苷酸序列 ,比较与其它GBRV基因同源性 ,预测其mRNA二级结构、蛋白质二级结构。方法 利用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术 ,从成人腹泻标本WH 1中扩增GBRVNSP2基因 ,克隆载体pUCmT ,对NSP2基因进行核苷酸序列分析。利用GeneBee软件比较与其它GBRV毒株NSP2基因同源性 ,Rnaviz2 .0软件绘制NSP2基因的二级结构 ,PredictProtein软件分析NSP2蛋白结构。结果 成人腹泻标本WH 1中GBRV非结构蛋白NSP2基因全长 10 0 7bp ,与ADRV核苷酸序列的同源性达 98% ,与印度加尔各达分离株CAL 1达 82 % ,与IDIR(鼠 )同源性仅为 79%。氨基酸序列与ADRV的同源性达 98.4 % ,与CAL 1达 97.7% ,而与IDIR仅为 89.0 %。其mRNA折叠形成多达 2 6个发卡环状结构。NSP2蛋白是由 30 1个氨基酸残基组成的多肽 ,含有 2个潜在的N 糖基化位点和多个磷酰化位点。结论 成人腹泻标本WH 1中GBRV非结构蛋白NSP2基因和氨基酸序列与人GBRV有较高的同源性 ,而与动物中GBRV同源性相对较低 ,其中与ADRV的同源性最高 ,推测GBRVWH 1株与ADRV具有相同起源。