2种不同ING1 mRNA剪接体在大肠癌组织中的表达研究

目的 探讨抑癌基因ING 1在大肠癌发生和进展中的作用和意义。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR )检测ING 1mRNA的表达 ;用单链构像多态性分析 (PCR SSCP)方法进行突变检测 ;用微卫星位点进行杂合性缺失 (LOH )分析。结果p3 3 /ING 1mRNA和p47/ING 1mRNA在大肠癌组织中的表达强度明显弱于正常大肠黏膜组织者 ;这 2种不同ING1mRNA剪接体之间的表达强度相一致。DukesC、D期患者癌组织中这 2种ING 1mRNA的表达强度明显弱于DukesA、B期者。 3 5例中均未发现ING 1基因突变 ,仅有 4例 ( 11.4% )出现微卫星位点的LOH。结论 p3 3 /ING1mRNA和p47/ING 1mRNA在大肠癌组织中的表达强度相一致 ;它们的低表达与大肠癌的发生、进展有密切关系。ING 1基因的突变和杂合性缺失少见 。

RHD mRNA剪接体与RhD抗原表达的相关性及其在输血及妊娠中的免疫应答研究

目的通过探讨RHD mRNA剪接体多态性与RhD抗原表达的强度在临床输血、妊娠中的异常免疫应答,为RhD血型定型标准与输血原则提供理论依据。方法选择案例1:RhD阳性(血清学凝集强度达4+)的男性患者因为多次输RhD阳性血合并自身免疫性疾病,血浆中产生了抗-D。案例2:RhD弱阳性孕妇怀孕RhD阳性胎儿产生了抗-D。案例3:Rhccdee表型的地贫患儿因长期(8年)输注常规定型为RhD阴性的血液后产生了抗-D。以上3例样本提取全血的mRNA通过反转录成cDNA,使用RT-PCR法通过自主设计的引物进行扩增测序与分析RHD mRNA剪接体的多态性结构。结果所选的3例患者中患者1、患者2均以3种剪接体的多态性表达了RHD基因。患者1的RHD mRNA剪接体形式:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,并且在exon-3的第426位发生C>A突变、exon-5的707位发生A>G突变、713位发生T>C突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;患者2的RHD mRNA剪接体:剪接体1与RHD基因参比序列全长一致,剪接体2与RHD基因参比序列相比缺失exon-8,9,未发现其他核苷酸突变,剪接体3与RHD基因参比序列相比缺失exon-7,8,9;因为患者3是RhD阴性,缺失RHD基因全部外显子,因此未检测到RHD mRNA剪接体的多态性。结论 RhD抗原的表达直接受RH基因调控,RhD mRNA剪接体的多态性决定RhD抗原强度的差异。RhD抗原弱阳性或阴性的受血者在接受RhD阳性血液时也受同种异体免疫产生抗-D的风险。

小鼠釉丛蛋白基因不同mRNA剪接体的克隆

目的 :克隆小鼠釉丛蛋白基因不同mRNA剪接体 ,分析小鼠釉丛蛋白的多态性。方法 :采用异硫酸氰胍一步法从新生小鼠磨牙牙胚组织中提取总RNA ,反转录成cDNA第一链 ,经PCR扩增出小鼠釉丛蛋白基因特异片段 ,插入pBS质粒 ,筛选阳性克隆 ,并经酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果 :克隆T1序列与已发表的完整釉丛蛋白mRNA序列一致。克隆T2序列与完整釉丛蛋白mRNA序列比较 ,缺失序列的 84～15 8的 75个碱基片段。结论 :小鼠釉丛蛋白基因在转录mRNA时 ,可产生不同的剪接体。

GYP mRNA基因可变剪接对MNS血型糖蛋白GPA和GPB在细胞表面定位的影响

目的分析MNS血型相关基因GYPA、GYPB mRNA剪接体多态性,探讨各种剪接体编码的GPA和GPB蛋白异构体的亚细胞定位与MNS血型抗原表达的相关机理。方法随机选取无偿献血者10份血液,提取外周血总mRNA,反转录为cDNA后,以巢式PCR方法扩增GYPA、GYPB基因的开放阅读框并进行Sanger测序,碱基序列与GYPA(NCBI:NM_002099)、GYPB(NCBI:NM_002100.5)比对。得到的GYPA、GYPB开放阅读框的野生型及各种剪接异构体编码序列后,通过融合PCR技术分别与绿色荧光蛋白(GFP)编码基因融合并克隆后转染到HEK293细胞进行过表达,通过聚焦激光扫描显微镜监测GPA-GFP和GPB-GFP融合荧光蛋白的亚细胞定位。结果2例标本的GYPA mRNA中缺失外显子1与外显子2,预测的GPA蛋白异构体缺失2~26位氨基酸,GYPB mRNA全长序列完整。6例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA中缺失外显子2,预测的GPB蛋白异构体缺失13~45位氨基酸,其他外显子序列完整。1例标本的GYPA mRNA完整,GYPB mRNA的外显子5中364~385位碱基被AG替换,显示氨基酸信号肽截短。其他标本的GYP mRNA全长序列完整。GP-GFP融合蛋白的荧光信号的观察结果表明,根据各RNA剪接体克隆表达的GPA、GPB糖蛋白异构体均可表现出细胞膜表面定位分布,其中的一些可变剪接导致蛋白异构体发生不同程度的细胞内弥散,影响蛋白在细胞表面分布的速度和比例,可能构成MNS抗原强弱的原因之一。结论GYP mRNA剪接体有明显多态性特征,但GYP mRNA的部分片段缺失不影响其编码的蛋白异构体在细胞表面的定位分布,能够确保其展示MNS抗原特性。

系统性红斑狼疮患者脱氧核糖核酸酶1基因表达研究

目的 研究脱氧核糖核酸酶 1(deoxyribonuclease ,DNASE1)基因表达及 m RNA剪接形式与系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus,SL E)的关联性。 方法 以实时荧光定量聚合酶链反应 (real- time PCR)方法检测 DNASE1的 m RNA表达水平 ,以毛细管电泳技术分析 m RNA编码区替代剪接体 ,结合单核苷酸多态性 (single nucleotide polymorphisms,SNPs)单倍型了解基因结构对表达的影响。 结果 SL E患者 DNASE1基因表达水平显著高于正常对照 (P<0 .0 0 1) ,未发现 SL E疾病活动性指数积分与基因表达水平存在相关性 ,但性别分析显示女性患者 DNASE1基因表达水平高于男性患者 (P<0 .0 1)。 8名正常人与 18例患者的毛细管电泳结果显示 ,患者与正常人替代剪接谱系不同 ,且 380 bp处存在明显条带 ,具有不同单倍型的 SL E患者替代剪接谱系亦有差异。 结论 SL E患者 DNASE1基因表达异常 ,并存在与正常人不同的 m RNA剪接体。 DNASE1基因与 SL