ET-1mRNA反义寡核苷酸治疗模式下糖尿病大鼠生存状况及肾脏病理进展研究

目的对糖尿病肾病(DN)大鼠模型利用内皮素反义寡核苷酸(ET-1AS-ODN)技术进行干预治疗,探讨ET-1AS-ODN在糖尿病肾病(DN)早期肾功能的保护作用。方法使用64只健康的SD雄性大鼠,通过腹腔注射链尿佐菌素(STZ)以剂量为55~60 mg/kg的方法制备糖尿病模型。随后,对其中32只大鼠给予ET-1AS-ODN 6 OD/kg/wk的治疗。在治疗过程中,对大鼠的生存状况及肾功能病理进展情况进行动态观察和测量。结果经过2、4、6、8周实验动物饲养后,与生理盐水对照组相比,8周后模型组(DM)生存率极低(P<0.05),肾功能检测血肌酐(Scr)、尿肌酐、尿素氮(BUN)水平、ET-1含量显著增高。ET-1AS-ODN治疗组在8周后效果显著,能够明显降低DN大鼠的血肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)水平,并提高肌酐清除率(Ccr),其差异有统计学意义(P<0.05)。结论经AS-ODN早期干预治疗可以有效改善糖尿病大鼠的生存状态,并对肾功能具有保护作用。

IL-6/IL-6受体mRNA反义寡核苷酸抑制骨吸收的实验研究

目的 探讨 IL- 6及其受体反义寡核苷酸在体外对骨吸收的影响及意义。方法 分离培养新生小鼠颅盖骨器官 ,分别用 IL- 6m RNA反义寡核苷酸 (ASON- 1 )、IL- 6受体 m RNA反义寡核苷酸 (ASON- 2 )、无义寡核苷酸 (NSO)、IL- 6或 IL- 6联合 ASON- 1及 ASON- 2作用培养颅盖骨 ,未加药组为对照。培养 48h后 ,取培养上清液测定钙含量 ,将实验组钙含量与对照组钙含量比值作骨吸收指数。结果 ASON- 1和 ASON- 2均可轻度降低培养颅盖骨的骨吸收指数。二者在浓度为 5μmol/ L时对骨吸收指数的抑制百分率分别为 1 0 .8%和 8.6% ,且 ASON- 1的作用有一定的剂量依赖关系 ;IL- 6作用颅盖骨使骨吸收指数呈剂量依赖性升高 ;当 IL- 6(40 ng/ ml)分别与 5μmol/ L ASON- 1或 5μmol/ L ASON- 2共同作用颅盖骨时 ,IL - 6对骨吸收的刺激性作用均受到抑制 ,其抑制百分率分别为 1 9.3%和 58.0 % ,ASON- 2对 IL- 6的抑制作用明显强于 ASON- 1 ;NSO对骨吸收指数无影响。结论 ASON- 1和 ASON- 2均能轻度抑制正常的颅盖骨骨吸收 ;对 IL- 6刺激导致的颅盖骨骨吸收 ,ASON- 2的抑制作用明显强于ASON- 1。

绿色荧光蛋白基因mRNA反义寡核苷酸的筛选和应用

基因mRNA的靶点筛选是设计反义寡核苷酸的关键.建立了PARASS(polyAanchoredRNAaccessiblesitesscreening)方法,即通过在mRNA末端引入polyA,与生物素标记的polyT退火结合,将其同链亲和素磁珠混合,使mRNA通过3’末端得到固定,保持mRNA的自然伸展和折叠,与寡核苷酸文库杂交筛选mRNA的结合靶点.PARASS筛选获得了绿色荧光蛋白(GFP)mRNA的3个反义寡核苷酸结合靶点,据其设计了多条反义寡核苷酸,与对照组相比,体外RNaseH分析显示3个靶点均为有效,在HeLa细胞内针对靶点的反义寡核苷酸能抑制GFP的表达,得到了Northern印迹结果支持.PARASS对反义寡核苷酸药物设计具有应用价值.

内皮素-1 mRNA反义寡核苷酸预防大鼠急性缺血性心律失常

本实验夹闭雄性SD大鼠冠状动脉左前降支（LAD）造成急性心肌缺血，观察LAD闭塞后1h内缺血性心律失常的发生。在LAD夹闭前2h，静脉注射本室设计的人内皮素-1mRNA反义寡核苷酸（AS-ODN）以阻断ET-1mRNA表达，观察AS－ODN对血浆ET-1浓度和急性缺血性心律失常的影响。结果显示，AS-ODN预处理组大鼠血浆ET-1浓度显著降低，心律失常的发生率及严重程度均低于生理盐水或正义寡核苷酸对照组，并表现出剂量依赖性，表明人ET-1AS－ODN可有效预防大鼠急性缺血性心律失常，提示内源性ET-1可能在急性缺血性心律失常的发生中起重要作用。

bcl-2 mRNA反义寡核苷酸对胃癌SGC-7901细胞端粒酶活性的影响

目的 探讨bcl 2反义寡核苷酸 (antisensephosphorothioateoligodeoxynucleotide,ASODN)对胃癌SGC 790 1细胞端粒酶活性的影响。方法 应用脂质体瞬时转染法介导bcl 2反义寡核苷酸 ,处理人胃癌细胞系SGC 790 1后 ,分别采用Northernblot、Westernblot检测bcl 2mRNA、蛋白表达 ,用端粒微孔板杂交法检测端粒酶活性。结果 bcl 2ASODN处理的胃癌SGC 790 1细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,并与ASODN的浓度和处理时间有关。结论 bcl

靶向HER-2 mRNA反义寡核苷酸对SK-BR-3乳腺癌细胞Caspase-3蛋白表达的影响

目的 检测HER 2特异性的反义寡核苷酸HA82 4对SK BR 3乳腺癌细胞Caspase 3蛋白表达的影响。 方法 选用HER 2高表达的SK BR 3乳腺癌细胞株作为试验的细胞株。HA82 4合成如前所述 ,HA4为已报道的阳性序列 ,Scramble设定为随机对照序列。上述药物分别以浓度为 2 0 0nmol·L-1孵育SK BR 3细胞 8h和 36h ,之后采用逆转录PCR法与免疫细胞化学技术检测SK BR 3细胞HER 2mR NA及Caspase 3蛋白表达水平。 结果 与Scramble对照序列相比 ,HA82 4、HA4能抑制HER 2mRNA的表达 ,HA82 4作用更强 ;与Scramble相比 ,HA82 4、HA4对Caspase 3蛋白表达水平则无影响。结论 HA82 4、HA4这两种靶向HER 2mRNA反义药物对SK BR 3乳腺癌细胞株增殖的抑制作用可能与激活Caspase 3蛋白无关。

Survivin mRNA反义寡核苷酸诱导胰腺癌细胞凋亡

目的:用反义寡核苷酸(ASODN)封闭胰腺癌细胞中Survivin 基因的表达,研究其诱导细胞凋亡的作用及其机制. 方法:用脂质体介导SurvivinASODN转染人胰腺癌细胞株SW1990细胞,用Annexin Ⅴ-FITC/PI复染、流式细胞术检测及电镜术观察凋亡,激酶活性检测法测定细胞内caspase-3活性变化,免疫沉淀法测定细胞内丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)活性的变化早期细胞变化情况. 结果:脂质体介导SurvivinASODN转染胰腺癌细胞后细胞内p38MAPK及caspase-3活性较对照组明显升高(55.3% vs 2.9%,3.2%,4.5%,4.8%respectively,P<0.05).细胞出现典型的凋亡形态学特征,细胞凋亡率较对照组明显增加(8.81±1.33 vs 47.87±2.91,and 14.73±1.36 vs 23.47±3.61.P<0.05). 结论:脂质体介导转染Survivin ASODN可以诱导细胞激活,诱导活化进而诱导细胞发生凋亡.

PDGF-β mRNA反义寡核苷酸抑制兔血管内膜损伤后血管平滑肌细胞增生(英文)

目的以PDGF-β的反义寡核苷酸作为药物抑制血管平滑肌细胞表达PDGF-βmRNA和增生,为反义药物预防经皮血管内膜成形术后再狭窄提供实验依据。方法用球囊导管损伤兔髂动脉内膜建立再狭窄模型,于内膜损伤后1周观察血管平滑肌细胞表达PDGF-βmRNA和增殖细胞核抗原的情况。结果计数200个内膜细胞中的PCNA阳性反应的细胞数,与对照组相比,反义药物显著抑制内膜平滑肌细胞表达PC-NA,抑制率为93.44%(P <0.001)。显微镜高倍视野下(400×) 计数血管内膜每平方毫米中的 PDGF-βmRNA阳性细胞的平均数,与对照组相比,反义药物显著抑制内膜平滑肌细胞表达PDGF-β mRNA,抑制率为 88.40%(P <0.001)。结论根据不同种属 PDGF-β的同源性设计的反义药物显著下调血管内膜表达PDGF-βmRNA并可抑制血管内膜增生,这为临床应用反义寡核苷酸防治经皮血管内膜成形术后再狭窄提供实验依据。

LMP-1 mRNA反义寡核苷酸抑制大鼠成骨细胞的分化

为深入探讨LIM矿化蛋白 1(LMP 1)在成骨细胞分化中的作用 ,体外培养大鼠成骨细胞 ,在培养基中加入LMP 1反义寡核苷酸 (LMP 1antisense终浓度为 0 8mol L) ,以阻断大鼠成骨细胞中LMP 1mRNA的表达。对照组加nonsense(终浓度为 0 8mol L)。测定细胞的碱性磷酸酶 (ALP)活性、培养基中骨钙素 (OC)的含量 ,免疫组化分析Ⅰ型胶原蛋白的表达 ,Northernblotting检测Ⅰ型胶原mRNA的表达。结果显示 :LMP 1mRNA被LMP 1antisense阻断后 ,ALP活性降低、OC分泌减少、Ⅰ型胶原蛋白和mRNA的表达下降。上述结果表明 :LMP 1mRNA被LMP 1反义寡核苷酸阻断后 ,成骨细胞分化受到明显的抑制 ,提示LMP 1是成骨细胞分化必不可少的正调节因子。

^(99m)Tc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸探针

目的建立９９ｍＴｃ标记反义寡核苷酸（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，简称ｏｌｉｇｏ）的方法。方法将联肼尼克酰胺衍生物偶联到人工合成的１５ｍｅｒｃｍｙｃｍＲＮＡ反义ｏｌｉｇｏ末端连接的氨基上，以三羟甲基甘氨酸做协同配体进行９９ｍＴｃ标记，用ＳｅｐＰａｋ反相柱纯化９９ｍＴｃｏｌｉｇｏ，并评价其特性。结果标记率为６０％～８０％，纯化后９９ｍＴｃｏｌｉｇｏ的放化纯度在室温４小时内保持＞９５％，比活度在５～４２ＭＢｑ／μｇ范围。对照组标记到ｏｌｉｇｏ上的放射性＜５％。９９ｍＴｃｏｌｉｇｏ在新鲜人血清中稳定，不被核酸酶降解，也不与血清中蛋白质结合，打点杂交证实９９ｍＴｃ标记的反义探针探测其靶序列（正义链）ＤＮＡ的最大可探测灵敏度为３０ｎｍｏｌ／Ｌ。

bcr/abl mRNA反义寡核苷酸对慢性粒细胞白血病Ph^+细胞的作用

Ph^+慢性粒细胞白血病(CML)的bcr/abl融合基因在其发病机制中具有重要作用。为研究bcr/abl反义寡核苷酸对CML细胞的作用,将合成两种18个碱基的bcr/abl硫代反义寡核苷酸与相应CML细胞系(K562细胞)及患者细胞共同孵育。结果发现,bcr/abl反义寡核苷酸可明显抑制K562细胞生长;对CML细胞CFU-GM抑制率为54％—91％,部分病例CFU-GM可有bcr/abl mRNA消失而PCR检测为阴性。上述抑制都是序列特异性的,与剂量呈正相关关系。通过流式细胞仪PI染色分析DNA含量,检测具有凋亡间接特征的亚二倍体细胞数量,发现反义寡核苷酸诱导细胞凋亡是其主要作用机制。本实验为bcr/abl反义寡核苷酸CML基因治疗及体外骨髓净化提供了依据。

脂质体介导的^(99)Tc^m标记c-mycmRNA反义寡核苷酸的初步研究

在 99Tcm 标记 DNA的基础上 ,采用阳离子脂质体对其进行包裹 ,获得了脂质体介导的 99Tcm-DNA。包裹后的标记物反义寡核苷酸、正义寡核苷酸、无义寡核苷酸的放化纯度分别为 ( 96.5±3.5) %、( 95.3± 3.2 ) %、( 94 .9± 4 .5) % ;比活度分别为 2 .0± 0 .5、1.0± 0 .2、1.4± 0 .3GBq· g-1;介导后的寡核苷酸与水、血清孵育后 ,只有极小量 99Tcm脱落 ,表明其稳定性较好。

IL-6受体mRNA反义寡核苷酸抑制骨吸收的体外研究

目的 :探讨IL 6RmRNA特异反义寡核苷酸 (ASON)在体外对骨吸收的影响及意义。方法 :采用器官培养法培养新生的小鼠颅盖骨 ,并分别用ASON、无义寡核苷酸 (NSO)、IL 6或ASON与IL 6联合处理颅盖骨 ,未加药组为对照。培养一定时间后 ,测定培养上清液的钙含量 ,将实验组钙含量与对照组钙含量比值作骨吸收指数。结果 :作用 4 8h后 ,不同剂量的ASON均可轻度降低骨吸收指数 ,但无剂量依赖关系 ,ASON(5 μmol/L)对正常培养的颅盖骨的骨吸收的抑制率为 8.6 % ;用IL 6培养颅盖骨使骨吸收指数呈剂量依赖关系升高 ,ASON(5 .0 μmol/L)可能明显抑制由IL 6 (4 0μg/L)引起的高骨吸收指数 ,其抑制率为 5 8.0 % ;NSO对骨吸收指数无影响。ASON(5 .0 μmol/L)分别作用 1 2、2 4、4 8h的骨吸收指数则随时间延长而降低。结论 :ASON阻断IL 6R表达后明显抑制IL 6刺激所致的新生小鼠颅盖骨骨吸收 。

脂质体介导的^(99m)Tc标记c-myc mRNA反义寡核苷酸的反义作用效果的研究

目的 探讨脂质体介导的 99m Tc标记癌基因 c- m yc m RNA的反义寡核苷酸能否抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表达。方法 合成 15 bp的癌基因 c- m yc m RNA的反义、正义及无义寡核苷酸 ,用 99m Tc标记后 (简称 99m Tc- DNA) ,一部分用脂质体包裹 ,以不同放射性强度的 99m Tc- DNA及脂质体包裹的 99m Tc- DNA转染细胞 ,于转染后不同时间测定细胞摄取率 ,在转染后 18h测定细胞返流比率 ,用四唑盐比色实验检测反义抑制细胞的生长状况 ,用流式细胞术测定癌蛋白的表达。结果 在 1～ 5 h内 ,细胞的摄取率随时间的延长而增加 ,脂质体包裹的 99m Tc- DNA的细胞摄取率明显高于未用脂质体包裹的 99m Tc- DNA。四唑盐比色实验 ,随着脂质体介导的 99m Tc-反义 DNA剂量的增加 ,细胞数量逐渐减少 ,而正义、无义寡聚核苷酸组 ,细胞数量则没有减少的趋势。细胞的返流比率 ,反义、正义、无义寡核苷酸分别为 3 9.5 1%、44 .12 %、63 .92 %。测定癌蛋白的荧光强度 ,反义寡核苷酸组 2 .9860± 0 .3 73 3、正义寡核苷酸组 4.2 60 0± 0 .2 2 18、无义寡核苷酸组 5 .2 62 0± 0 .85 62 ,反义寡聚核苷酸组的荧光强度明显低于正义和无义寡聚核苷酸组。结论 脂质体介导的99m Tc标记的反义寡核苷酸能抑制癌细胞的生长和癌蛋白的表?

Livin mRNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞株HepG-2体外增殖及凋亡的影响

目的探讨LivinmRNA反义寡核苷酸(ASODN)进行肿瘤基因治疗的可行性。方法设计合成嵌合骨架型ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),脂质体转染到HepG-2细胞(观察1组和观察2组),同时设未转染者为对照组。采用MTT法检测HepG-2细胞增殖抑制率(IR),电镜、流式细胞仪与吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)细胞染色法检测细胞凋亡水平和形态学变化。结果ASODN在终浓度200nmol/L作用72h时,观察1组HepG-2细胞IR及细胞凋亡数明显高于其他两组。结论以Livin为靶点的ASODN能够促使肿瘤细胞凋亡,具有靶特异性和低毒性,有可能成为抗肿瘤药物开发的新工具。

反义寡核苷酸的作用机制及其在运动系统中的研究进展

反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides,ASOs)是一类新型的小分子基因靶向药物,可与目的mRNA结合,ASOs以其与目标序列互补的碱基配对方式,对基因进行靶向调控。随着基因测序技术和分子合成技术的不断发展,ASOs在运动系统中的研究和应用进一步深入。本文阐述了ASOs在基因沉默和表达调控中的作用机制,以及其在基因治疗方面的应用前景。此外,还介绍了ASOs在运动系统疾病中的研究进展和应用情况,并分析此类药物目前所面临的问题,旨在深化医务人员对ASOs的认识,并为其在生物医学研究和临床中的推广应用提供有益参考。

反义寡核苷酸药物在神经系统疾病治疗中的研究与应用

神经系统疾病的病因及病理机制复杂且研究难度大,靶点发现及相应的药物研发困难。随着基因组及转录组测序等技术的发展,有关神经系统疾病的遗传形式、非遗传性或散发性神经系统疾病的靶点发现及分子机制取得了有效进展。基于转录组靶点发现的小核酸药物研发为神经系统疾病的新药开发领域提供了一种新的思路。反义寡核苷酸药物属于小核酸药物的一种,相比于以蛋白为靶点的传统小分子药或抗体药物,靶向mRNA的反义寡核苷酸具有候选靶点范围大、药物靶点筛选快、研发成功率高等优点。目前,反义寡核苷酸药物在神经退行性疾病领域的治疗广受各药物研发企业重点关注,具有良好临床应用前景。本研究总结反义寡核苷酸药物在多种神经系统疾病治疗中的研究与应用,回顾其作用机制、研发优势以及结构修饰方法的发展,并探讨用于治疗神经系统疾病的反义寡核苷酸药物临床用药及研发的最新进展,旨在为神经系统疾病、尤其是罕见病及难治病的新药研发提供借鉴和参考。

阿斯利康反义寡核苷酸药物获FDA批准上市

近日,阿斯利康宣布美国食品药品管理局(FDA)已批准反义寡核苷酸(ASO)疗法Eplontersen(商品名:Wainua)上市,用于治疗成人遗传性转甲状腺素蛋白(TTR)介导的淀粉样变性的多发性神经病(ATTRv-PN)。

靶向HER-2 mRNA反义硫代寡核苷酸体外抗乳腺癌活性研究

目的研究以HER2mRNA为靶点的反义硫代脱氧寡核苷酸(SODNs)HA6722对HER2过表达乳腺癌细胞株MDAMB453体外增殖的抑制作用,及HA6722对肿瘤细胞HER2表达的影响。方法选择HER2过表达的MDAMB453细胞与HER2低表达的MDAMB231细胞,MTT法观察SODNs对肿瘤细胞增殖的影响,免疫细胞化学(ICC)与RTPCR方法研究SODNs对细胞HER2蛋白及mRNA表达的影响。结果HA6722可以剂量依赖方式抑制MDAMB453细胞的体外增殖,IC50值(41.8±8.1nmol·L-1,n=5,mean±s)显著低于对照序列Scramble6722(IC50=489.4±12.1nmol·L-1,n=5,P<0.01)。HA6722在蛋白水平与mRNA水平显著抑制MDAMB453细胞中HER2的表达;HA6722对MDAMB231细胞的体外增殖无显著影响(IC50=476.7±17.6nmol·L-1,n=5,P>0.05)。结论HA6722可序列特异性地抑制HER2过表达乳腺癌细胞的体外增殖,其抑制增殖作用与靶细胞HER2表达下调有关。