差异显示反转录PCR技术的建立和改进

本文对差异显示反转录ＰＣＲ（ＤＤＲＴ－ＰＣＲ）的一系列条件进行了探索和改进，建立了有效的ＤＤＲＴ－ＰＣＲ方法。特别是单锚定碱基引物Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）＿（１２）Ｍ（Ｍ＝Ａ，Ｇ，Ｃ）的应用，不但得到了十分良好的实验结果，而且在很大程度上降低了实验成本和工作量。

mRNA差异显示技术的研究进展

针对mRNA差异显示技术中的假阳性高和放射性污染等缺陷,文章从改进引物设计、应用非放射性标记、优化PCR参数、假阳性鉴定等方面进行了综述。1采用4种兼并或单碱基引物作锚定引物;用特异和长序列(≥20bp)专一性引物作为随机引物,可增加特异性;在锚定引物之前加上了一段T7启动子序列,在随机引物前加上一段M13重复序列,可使DDRT—PCR的体系的扩增特异性更一致。2针对放射性同位素检测法的缺点,文章提出并比较了几种常用的非放射性同位素标记方法。3保证起始(模板)mRNA质量和浓度,降低dNTP浓度,选择最适的反转录和PCR退火温度,可优化PCR参数。4用两种不同的反转录酶进行反转录平行实验,很容易区分出RNA制备过程中造成的假阳性,目前假阳性鉴定大多还是以Northern印迹为基础,再作些适当的改进。

差异显示PCR技术在念珠菌基因表达研究中的应用

目的探讨差异显示PCR技术(DD-PCR)在念珠菌基因表达研究中的方法学要点。方法将临床阴道来源的白色念珠菌氟康唑敏感菌株435体外诱导氟康唑耐药性,于诱导80d得到耐药子代435-2,采用长引物差异扩增、银染显示差异条带、反式点杂交预筛选及非放射性法标记探针的改良的DD-PCR,比较435与435-2在有药及无药培养基中的表达差异。结果在435-2含药培养组中得到较435-2、435无药培养组表达明显增强的片段N2、N3、N12,分别与数据库中白色念珠菌的醇脱氢酶基因ADH1、拓扑异构酶基因TOP2及多药耐药基因CDR1基因有高度同源性;半定量RT-PCR中证实了ADH1、CDR1基因在耐药株中的高表达。结论ADH1、CDR1基因的高表达与白色念珠菌氟康唑耐药性形成相关,ADH1可能是新的耐药基因;改良的DD-PCR技术降低了假阳性率的产生,使确证步骤更加便捷,在念珠菌研究领域有很好的应用前景。

老年喉癌组织中人乳头状瘤病毒E7及肿瘤增殖、迁移相关基因mRNA表达量的检测及临床意义

目的检测老年喉癌组织中增殖、迁移相关基因及人乳头状瘤病毒(HPV)E7 mRNA表达量并分析其临床意义。方法经临床明确诊断的喉癌、喉癌前病变、声带息肉患者共计88例,分为喉癌组、病变组、息肉组3组,分别扩增目的基因丝氨酸丰富剪接因子(SRSF)1、重组人微管解聚蛋白(STMN)1、结肠癌转移相关基因(MACC)1、生存素(Survivin)、β-链蛋白(catenin)、E-钙黏蛋白(cadherin)、N-cadherin、红细胞波形蛋白纤维(Vimentin)、CD44v6、基质金属蛋白酶(MMP)-9、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-1、Beclin1及内参基因GAPDH,计算其mRNA含量。结果喉癌组HPV-16及HPV-18的E7 mRNA含量均显著高于病变组和息肉组(P<0.05);喉癌组织中增殖基因SRSF1、STMN1、MACC1、Survivin的mRNA含量显著高于病变及息肉组(P<0.05);喉癌组织中E-cadherin、β-catenin的mRNA含量显著低于病变组和息肉组(P<0.05);喉癌组织中Ncadherin、Vimentin、CD44v6、MMP-9的mRNA含量显著高于病变组和息肉组(P<0.05);喉癌组织中Caspase-1、Beclin1的mRNA含量均显著低于病变组和息肉组(P<0.05)。结论喉癌组织中HPV mRNA表达量异常升高,并与喉癌细胞增殖、迁移相关基因表达量相关。检测HPV E7 mRNA可以为喉癌的预防、发展监测提供重要的临床指导。

人脂肪细胞总RNA的抽提及对脂联素mRNA的扩增

目的建立一种提取脂肪组织总RNA并能够有效地进行反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法。方法利用Trizol试剂提取人皮下脂肪组织总RNA,用紫外分光光度法鉴定其产率及纯度,用琼脂糖凝胶电泳和RT-PCR鉴定所提取的总RNA的完整性。结果采用选择性mRNART-PCR试剂盒特异性地扩增出脂联素(adiponectin)和β肌动蛋白(β-actin)的mRNA。结论在脂肪组织总RNA抽提中容易混入基因组DNA,而采用选择性mRNART-PCR只针对mRNA进行特异的扩增。

肝素酶表达鉴别良、恶性腹水无价值

目的:研究腹水脱落细胞及腹膜活检标本中肝素酶的表达,探讨肝素酶用于鉴别良、恶性腹水的可行性.方法:采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测47例腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达,同时利用免疫组织化学法检测肝素酶蛋白在36例腹膜活检标本中的表达,与相关的临床资料进行分析.结果:肝素酶mRNA在良、恶性腹水脱落细胞中的表达无明显差异(P>0.05).在腹膜活检标本中,肝素酶蛋白不仅存在于腹膜癌细胞中,在结核性腹膜炎上皮样细胞、郎格罕巨细胞、淋巴细胞中及异位的子宫内膜细胞及其间质细胞中均有表达;免疫组织化学法检测腹膜组织中,良、恶性腹水组之间的肝素酶阳性率亦无显著性差异(P>0.05).结论:肝素酶在良性腹水中的高表达可能与腹水脱落细胞中的炎性细胞增高有关.腹水脱落细胞中肝素酶mRNA的表达不能用于良恶性腹水的鉴别.

肝郁证模型大鼠海马内差异表达片段生物信息学分析

目的:通过对肝郁证模型大鼠的海马内差异表达片段的分析,探讨生物信息学在证候研究领域的应用。方法:对实验前期分离出的差异表达片段进行生物信息学分析。首先利用UniGene数据库进行ESTs聚类,使用软件对ESTs进行拼接,完成拼接之后,对重新组装的contig进行注释。结果:差异表达的1号片段与12号片段分别代表了GSK3b与St3gal5这两个基因转录产物;进一步将GSK3b与St3gal5的功能加以分析后,提示这两个基因产物可能与肝郁证的发生、发展相关。结论:海马是逍遥散调节慢性不可预知温和应激的重要作用部位,众多基因参与了逍遥散对慢性应激的调节,生物信息学方法在证候研究方面有重要的意义。

环氧合酶-2在卵巢癌组织中的表达

目的:探讨环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)在卵巢癌组织中的表达及意义。方法:应用免疫组化和RT-PCR技术检测正常卵巢和卵巢癌组织中COX-2的表达情况。结果:检测的38例卵巢癌组织COX-2蛋白表达阳性23例,阳性表达率61%,33例表达COX-2mRNA,阳性表达率为87%;20例正常卵巢组织COX-2蛋白与COX-2mRNA均呈阴性表达。结论:COX-2在卵巢癌组织高表达,并在其发生发展中起重要作用。

单眼视觉剥夺大鼠视皮质基因表达差异的研究

本实验利用差异显示反转录PCR(DDRT PCR)技术分析单眼视觉剥夺大鼠左、右侧视皮质基因差异表达情况 ,并通过反Northern杂交去除假阳性筛选差异表达基因片段。最终获得 3个差异表达基因片段。通过克隆、测序和同源性比较发现 ,其中一个片段 5’端的 166个碱基与人KIAA0 541蛋白的mRNA编码区的166bp区段有 83%的同源性。

2周耐力训练对大鼠骨骼肌肌动蛋白和肌球蛋白重链基因表达的影响

目的:研究2周跑台训练对雄性SD大鼠骨骼肌肌动蛋白(α-actin)和肌球蛋白重链(myosinheavychain,MHC)基因表达的影响。方法:实验以20只雄性SD大鼠为研究对象,将其随机分为对照组和训练组。运动训练组大鼠进行连续2周强度约为75%VO2max(18.5～24米/分钟,坡度为0°,每次运动50分钟,每天2次)的跑台训练,采用半定量反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定股四头肌深层肌α-actin和MHCmRNA含量。结果:(1)连续2周跑台训练后,股四头肌α-actinmRNA表达增加了22%(P<0.01)。(2)连续2周跑台训练后,股四头肌MHCIIx、MHCIIbmRNA含量分别是安静对照组的109%(P<0.05)和108%(P<0.001),MHCIIb和MHCImRNA变化不明显,结论:(1)短期耐力训练能够提高骨骼肌α-actin基因表达;(2)短期耐力训练后,快型MHC中的两种慢型MHC异形体———MHCIIx、MHCIIa基因表达增加,但未引起快型MHCIIb和慢型MHCI基因表达的变化。

术前大黄素联合顺铂化疗对人食管鳞癌WIG-1mRNA的影响及其机制的研究

目的探讨术前大黄素联合顺铂化疗对人食管鳞癌野生型p53诱导基因1(WIG-1)mRNA的影响及机制。方法选择2017年3月～2018年10月我院收治的40例食管鳞癌患者作为研究对象,所有患者均经术前病理组织检查确诊。患者确诊后均给予大黄素联合顺铂进行术前化疗,连续治疗3个疗程后对患者行手术治疗,根据术中所取组织部位的不同,分为观察组和对照组,每组各20例。观察组术中取病灶组织,对照组术中取癌旁组织(距离肿瘤部位≥3 cm)。运用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术测定两组患者组织中的WIG-1m RNA表达水平和观察组手术前后WIG-1mRNA的表达水平。结果观察组患者组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.68±0.11,高于对照组的0.04±0.01,差异有统计学意义(P<0.05);观察组患者手术后食管鳞癌组织中的WIG-1mRNA表达水平为0.25±0.05,低于手术前的0.68±0.11,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 WIG-1mRNA在正常组织中表达水平较低,且术前大黄素联合顺铂化疗用于食管鳞癌患者中有助于降低WIG-1mRNA的表达水平,有助于改善患者的预后,能为食管鳞癌的治疗提供分子学依据。

mRNA差异显示法克隆前列腺癌相关基因

目的 克隆前列腺癌相关基因。 方法 应用改进的mRNA差异显示技术 ,从前列腺癌患者和正常成人前列腺组织中获得两者的差异片段 ,即表达序列标签 ,克隆测序分析 ,采用逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)方法证实。 结果 正常成人和前列腺癌患者的前列腺组织存在明显的基因表达差异。在GenBank分析的 7个差异显著的片段中 ,5个为新基因片段 ,1个与基因聚集素(clusterin) 10 0 %同源 ,在前列腺癌组织中高表达 ;另一个与超氧化物歧化酶 1(SOD1) 97%同源 ,在正常前列腺组织中高表达。RT PCR结果证明前列腺癌组织及前列腺癌细胞株中 ,clusterin与内参基因β actin的相对表达量明显高于正常前列腺组织。 结论 5个新基因片段、clusterin和SOD1基因表达在前列腺癌的发生、发展中可能发挥重要作用。

支气管哮喘患者粒-巨噬细胞集落刺激因子mRNA表达的研究

目的探讨利用无创伤性方法寻找较为特异性地反映哮喘患者气道炎症的客观指针。方法通过研究哮喘者患者气道粘膜细胞粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)mRNA表达,并以此为参照,分析哮喘患者诱导痰细胞GM-CSFmRNA表达变化;利用免疫组化结合逆转录聚合酶链反应(TR-PCR)技术,分析哮喘组(10例)气道粘膜细胞GM-CSFmRNA表达;用3％高渗盐水诱导痰液,利用TR-PCR技术分析哮喘组(15例)、慢性支气管炎组(15例)和对照组(11例)诱导痰细胞GM-CSFmRNA表达。结果(1)哮喘组气道粘膜嗜酸细胞、淋巴细胞和活化嗜酸细胞EG2细胞数与病情程度呈正相关(r=0.82,P<0.05);(2)哮喘组气道粘膜细胞GM-CSFmRNA表达与对照组比较差异有显著性(P<0.05),并且GM-CSFmRNA的表达与EG2细胞数明显相关(r=0.73,P<0.05)。(3)嗜喘组诱导痰嗜酸细胞相对计算与慢性支气管炎组和对照组比较差异均有显著性(P<0.05);(4)哮喘组诱导痰细胞GM-CSFmRNA表达与慢性支气管组和对照组比较差异均有显著性(P<0.05);慢性支气管炎组与对照组比较,差异也有显著性(P<0.05)。结论诱导痰细胞GM-CSFmRNA过度表达能够较为特异地判断哮喘气道炎症。

急性创伤患者早期中性粒细胞热休克蛋白72的表达意义

目的探讨急性创伤患者应激早期各时间段中性粒细胞中热休克蛋白72(HSP72)含量及其编码基因表达与患者预后的相关性。方法随机选取收入重症监护治疗病房的急性生理学与慢性健康状况Ⅲ(APACHEⅢ)评分≥18分的患者30例,分离创伤后0-1d、2-6d和7-14d的中性粒细胞。应用免疫组化技术检测HSP72的蛋白表达,半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSP72mRNA表达水平,同时记录患者2个月的存活率。结果HSP72在急性应激后表达明显增强,表达高峰在2-6d,存活组HSP72的水平较死亡组明显升高。结论HSP72的蛋白和基因水平表达高峰在急性创伤后2-6d,其含量及表达与急性创伤患者2个月存活率存在相关性。

白念珠菌对角质形成细胞Toll样受体2表达的影响

目的:探讨白念珠菌和甘露聚糖对人角质形成细胞Toll样受体2(TLR2)表达的影响。方法:用白念活菌和甘露聚糖分别刺激培养的人角质形成细胞24h,然后用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测细胞TLR2mRNA表达,免疫组化SP法检测TLR2蛋白表达,并进行半定量分析。结果:正常培养的人角质形成细胞有TLR2mRNA和蛋白表达,白念珠菌和甘露聚糖刺激角质形成细胞24h后,TLR2表达量没有统计学差异(P>0.05)。结论:角质形成细胞有TLR2mRNA和蛋白水平的组成性表达,白念珠菌和甘露聚糖对TLRR2表达均无明显影响,推测角质形成细胞表面可能存在多个识别念珠菌及其产物甘露聚糖的受体,TLR2只是其中之一。

性激素受体在人眼角膜组织中的表达

目的检测人角膜组织中是否有雄激素受体(androgenreceptor,AR)、雌激素受体(estrogenrecep-tor,ER)和孕激素受体(progesteronereceptor,PR)的表达。方法用逆转录聚合酶链反应(reversetranscriptase-polymerasechainreaction,RT-PCR)的方法检测人眼角膜组织中性激素受体蛋白mRNAs(AR,ERα,PR)的表达,用免疫组织化学技术(immunohistochemicaltechnique)来定位这些受体。结果人眼的角膜组织中检测到性激素受体的mRNAs,角膜上皮细胞的细胞核中免疫组化染色阳性。结论性激素受体在人的角膜组织中被发现,提示这些性激素可能与角膜组织中的受体结合来直接影响角膜的生物学功能。

EGF作用下人脑胶质瘤细胞生长抑制的机理

目的 克隆、测序胶质细胞瘤 BT325细胞在生长抑制量表皮生长因子 (epithelial growth factor EGF)作用下差异表达的基因,了解 BT325细胞生长抑制的分子机制。方法 在生长抑制量 EGF 作用下,用差异显示反转录聚合酶链反应 (differential display reversed transcription polym erase chain reaction DDRT-PCR ) 技 术 分析 人 胶 质 细胞瘤 BT325细胞表达 水 平 明显 差 异 的 cDNA , 对差 异 显 示 基因 进 行 序 列 测定 和 同 源 比较 , 并 用 Dot blot及 Northernblot等方法进行验证。结果 在 EGF 作用下,生长抑制的胶质瘤细胞中出现一些上调和下调表达的 cDNA 片段。克隆、分离了 6个表达明显上调的 ESTs,1个序列为新的基因片段,另 5个与已知基因有不同程度的同源,其中 1个与转醛缩酶基因的编码区同源。新近的研究已发现,转醛缩酶与细胞凋亡有关。结论 高剂量 EGF 可诱导 BT325中许多基因表达水平的改变,EGF 抑制 BT325细胞生长可能与促进转醛缩酶基因的表达而诱导细胞凋亡有关。

K562细胞向红系分化相关EST的鉴别与分析

目的 鉴别并获取与 K562细胞向红系分化相关的表达序列标签 (expressed sequence tags,EST)。方法利用改进的差异显示反转录聚合酶链反应 (differential display reverse transcription polym erase chain reaction DDRT-PCR )方法,分析诱导前及用氯高铁血红素 (hem in)诱导 36h 后 K 562细胞的差异表达 cDNA 片段,挑选其中差异明显的cDNA 片段,经克隆、测序和基因信息学分析,挑选代表新序列或有一定功能线索的差异表达 EST 进行 Northern 印迹分析。结果 获得诱导前后 K 562细胞的差异表达 cDNA 片段 60条,其中 38条表达上调,22条表达下调。对 40个差异表达明显的 cDNA 片段的生物信息学分析说明,23个 EST 与 GenBank 中已知序列有 95%以上同源性,10个为只与 dbEST 有高度同源的序列,7个未发现同源序列;进行 Northern 印迹分析的 8个差异表达 EST 中,6个 EST 的杂交结果与 DDRT-PCR 显示的差异表达状况一致。结论 改进的 DDRT-PCR 方法能够较好地克服假阳性问题,这些差异表达 EST 的获得为进一步研究红系分化的分子机制和控调网络提供了一定线索。

RT-PCR技术诊断猪瘟的应用研究

应用反转录—聚合酶链反应(RT-PCR)对猪瘟进行诊断应用研究。应用RT—PCR对来自广西不同地区的135份疑似猪瘟病料进行检测，84份诊断为阳性，阳性率62．296。从百色、柳州地区等采集的健康猪扁桃体和淋巴结共276份，经RT—PCR检测，37份为阳性，阳性率为13．4％。其中健康猪扁桃体带毒较高，246份扁桃体中有35份阳性，占14．2％。采自柳州健康猪的26份淋巴结材料全为阴性，只有邕宁县的1份健康猪淋巴结阳性。结果表明，RT-PCR技术可应用于猪瘟的临床诊断。