mRNA差异显示PCR的研究进展

mRNA差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究差异表达和性状差异的有效方法之一,该方法在生物的发育、性状和对各种生物、理化因子作用时应答过程基因表达的研究中应用十分广泛,笔者简述了mRNA差异显示PCR技术的基本原理、技术改进以及此技术在球虫抗药性研究中的应用。

mRNA差异显示PCR技术在水稻研究中的应用

mRNA差异显示PCR技术是在基因转录水平上研究基因差异表达和性状差异的有效方法之一,该方法在生物的发育、分化和对各种生物、理化因子作用时应答过程基因表达的研究中应用十分广泛。就mRNA差异显示PCR技术的基本原理、优点与不足、改进与完善等作了简要归纳,综述了该方法在水稻的发育分化、激素调控、抗逆性和抗病性等方面所取得的研究成果,并对该方法在水稻方面的应用前景作了简单分析。

施氏假单胞菌75 mRNA差异显示PCR方法的建立

为丰富原核生物基因表达差异的研究方法,将应用于真核生物中的差异显示PCR方法应用于原核生物基因差异表达的研究,以1株有机磷农药乐果的降解菌施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzer)75为研究材料,以5′末端依赖性的RNA外切酶(Terminator Exonuclease)降解其中的16S rRNA和tRNA,并用随机引物替代锚定引物,改良真核生物差异显示PCR,建立原核生物mRNA差异显示PCR的试验体系。以LB培养基培养的菌株为对照组,以无机盐培养基(乐果为唯一碳源)为试验组。结果表明:提取总RNA,通过5′-磷酸基团依赖的核酸外切酶降解法获得mRNA,经逆转录,用双随机引物扩增获得253个差异基因,16S rRNA、tRNA的污染较少,其中之一为硫酸盐运输蛋白基因。

mRNA差异显示PCR技术在妇科肿瘤研究中应用

mRNA差异显示技术(differential display-PCR,DD-PCR)是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法,可以比较多种样本间不同表达的基因。因该方法简便、敏感、可重复性强等特点,已成为研究肿瘤分子生物学基础的良好工具。综述DD-PCR技术在妇科肿瘤发生发展、耐药及转移机制研究中的应用。

用mRNA差异显示PCR技术筛查慢性砷中毒相关基因片段

目的 :对慢性砷中毒组织的表达差异基因进行分析。方法 :采用 m RNA差异显示 PCR技术 ( m RNAdifferential display PCR) ,以慢性砷中毒病人具有皮损表现的手掌部皮肤组织为标本 ,正常人体手掌部皮肤组织为对照 ,提取组织 m RNA,对砷中毒组织的表达差异基因进行分析 ,选择高表达和低表达的基因片段各一条进行了克隆和序列分析 ,经 RNA印迹法确证 ,并在基因数据库中进行了同源性比较。结果 :获得 2 5条差异表达明显的 c DNA片段 ,分别在砷中毒病人组织中呈高表达和低表达 ,已测序的两个序列均为未知基因序列。结论 :慢性砷中毒病人病变皮肤组织与正常人体皮肤组织相比在 m RNA水平有基因表达差异 。

利用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)研究大豆抗疫霉根腐病的分子机制

文章以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料,利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异,寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段,通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。

用mRNA RT-PCR差异显示技术克隆拟除虫菊酯抗性家蝇细胞色素P450基因片段

细胞色素P450单加氧酶系是一类广泛分布在生物有机体中的重要酶系,具有多样的功能。细胞色素P450介导的杀虫剂代谢解毒作用的增强是昆虫对杀虫剂产生抗性的普遍机制。为揭示家蝇对拟除虫菊酯类杀虫剂的分子基础,我们利用mRNA差异显示技术(DDRTPCR)从溴氰菊酯抗性品系家蝇Muscadomestica中分离出2个新的基因片段(M1,M2)。序列比对(BlastP)结果表明,M1与黑腹果蝇Drosophilamelanogaster中的Cyp6A9在氨基酸水平上具有54%的相似性,M2分别与果蝇Drosophilasimulans中的Cyp6g1有65%的相似性。M1和M2包含P450的特征序列,并与细胞色素P450具有最高程度的序列相似性,是为细胞色素P450基因片段。

mRNA差异显示技术、PCR技术及其在动物营养研究中的运用

21世纪将是生命科学的世纪。当前,世界各国都将分子生物学纳入本国科技发展的重点。分子生物学技术的迅速发展为营养科学探索必需营养缺陷的分子基础提供了强有力的实验工具。本文旨在对mRNA差异显示技术、PCR技术等两种最常用的生物技术手段的原理、特点及其在动物营养研究中的应用作一综述。

mRNA差异显示RT-PCR技术在昆虫学研究中的应用

mRNA差异显示RT- PCR是近 1 0年广泛使用的用于克隆和分析差异表达基因的有效技术。该文简要介绍了差异显示RT -PCR技术的原理、优缺点及其优化方法 ,重点综述了mRNA差异显示RT -PCR技术在昆虫学研究中的应用。

荧光差异显示PCR分离果蝇七氟醚敏感性相关基因

吸入麻醉药是临床上常用的一类全身麻醉药 .为深入研究吸入麻醉药的作用机理 ,以本实验室创建的对七氟醚敏感的果蝇品系 (F PS1 )和耐药 (F PR1 )的果蝇品系为研究模型 ,以野生型黑腹果蝇 (Drosophilamelanogaster)为对照 ,应用荧光mRNA差异显示PCR (fluorescentdifferentialdisplayreversetranscriptional PCR ,fluoroDDRT PCR)方法 ,分离与吸入麻醉药七氟醚敏感性相关的候选基因(EST) .在分离到的 32个差异片段中 ,经Northern印迹杂交鉴定后 ,得到 1个阳性片段 (No .4 1 ) ,其在敏感品系果蝇中表达较高 .通过cDNA末端快速扩增技术 (rapidamplificationofcDNAends ,RACE)克隆和拼接获得了 1 75kb的全长cDNA ,该基因位于Chr2R 4 5F3区域内 ,为一已知序列的新基因 .实验结果与前期工作用遗传学定位方法所得结果一致 ,从而可推测决定七氟醚敏感性的相关基因可能位于果蝇第 2号染色体上 .

mRNA差异显示技术、PCR技术及其在动物营养研究中的运用

21世纪将是生命科学的世纪。当前,世界各国都将分子生物学视为本国科技发展的重点。分子生物学技术的迅速发展为营养科学探索必需营养缺陷的分子基础提供了强有力的实验工具。笔者旨在对mRNA差异显示技术、PCR技术两种最常用的分子生物学技术手段的原理、特点及其在动物营养研究中的应用作一综述。

单个植入前胚胎mRNA差异显示方法的建立

在已有的研究基础上 ,优化和建立了单个植入前胚胎的mRNA差异显示 (singlepreimplantationembryodifferentialdisplaypolymerasechainraction ,SPEDDRT PCR) .以小鼠单个成熟的卵母细胞和单个的 2细胞期胚胎作为起始材料 ,比较二者之间基因的表达差异 .选择在卵母细胞中不表达而在 2细胞期表达的差异片段 .进行GenBank检索和表达序列标签 (EST)库电子克隆 .与多胚研究方法一样 ,由线粒体编码的和 2细胞特异表达的NADH脱氢酶亚单位 2和ATPase 6证实了SPEDDRT PCR方法是可行而且可靠的 ,是一种需要材料极少。

降低mRNA差异显示技术假阳性率的一种方法

为了探讨降低mRNA差异显示技术假阳性率的方法 ,进一步提高此技术的可靠性 ,提取了手术切除肝癌及非癌肝组织成对标本的总RNA ,逆转录获得cDNA片段 ,以mRNA差异显示方法筛选差异表达基因 ,选取较明显的一条差异表达条带 ,行进一步PCR扩增 .分别对PCR产物及其经TA克隆后随机挑选的 6个单克隆质粒DNA进行序列分析 ,并通过GenBank BLAST数据库进行序列的同源性比较 ,以Northern杂交予以来源确认 .自 72 0余条扩增条带中共选出 2 8条差异条带 .序列分析及同源性比较表明 ,所选择条带的PCR产物为一可能的新基因片段 ;而随机选择的 6个TA克隆质粒DNA中 ,有 4个为同一已知基因片段 ,一个为另一已知基因片段 ,一个为一可能的新基因片段 .同源性比较表明 ,PCR产物直接测序所得序列与TA克隆质粒DNA的 6个片段不具同源性 .结果表明 ,mRNA差异显示条带可能由 1条以上分子量相似的片段构成 ,直接对PCR产物行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,是导致出现假阳性片段的原因之一 .将PCR产物进行TA克隆 ,对单克隆质粒DNA进行序列分析并以其为探针进行Northern杂交 ,可能是解决此问题的一种较好方法 .

mRNA差异显示技术中差异条带的回收与再扩增

目的：对来源于两种或两种以上组织的ＲＮＡ经反转录和ＰＣＲ后进行比较。方法：采用ｍＲＮＡ差异显示过程中差异条带的回收与再扩增的方法。结果：直接将切下的凝胶条简单洗涤和碾碎后制备的再扩增模板比传统的糖原沉淀法简单有效。结论：再扩增过程中将３０循环的低退火温度的ＤＤＰＣＲ和２０循环的严格条件的ＰＣＲ结合，能获得较高的再扩增效率。

银染mRNA差异显示法的建立及其应用

以银染 m RNA差异显示方法对原发及转移灶胃癌标本总 RNA为研究对象进行银染差示分析和回收差异条带 ,从中获得系列差异表达片段 .随机选取 5个从原发性胃癌样品回收的表达条带 ,以取自体外培养胃癌细胞株的 RNA进行点杂交验证 ,均被证实为真实带 .对 2个差异表达片段进行分析、测序和 Gen Bank同源比较结果表明 :MGD1片段与肿瘤转移相关基因 MTA1完全同源 ,属胃癌转移相关基因 ;PGD2与胃癌转移抑制相关 ,并与细胞周期抑制蛋白 p2 7/ Kip1具 99%的同源性 .结果表明 ,银染差异显示法具有快速、直观、假阳性率低等优点 。

差异显示反转录PCR技术研究进展

分析一对细胞或组织在不同状态下基因表达的差异,已成为分子生物学研究领域的热点之一.近年来,用于识别差异表达基因的方法已发展起来多种.DDRTPCR是近年来较为广泛应用的一种技术.理论上,DDRTPCR技术比较简单,但实施起来却存在着假阳性率高,凝胶中单条cDNA带成分不均一,所获cDNA仅代表着mRNA3′UT区(约300bp)以及一些低拷贝数mRNA不能有效被呈现等问题.对DDRTPCR技术的改良也主要集中在解决这些问题方面.

用mRNA差异显示技术分离盐胁迫下小麦耐盐相关cDNA

目的用mRNA差异显示技术分离小麦盐胁迫应答cDNA,为进一步研究小麦耐盐机理奠定基础。方法将小麦(Triticum aesticum L.)耐盐品系宝丰7228r种子分别置于含NaC l 0‰和12‰的Hoagland培养液中生长,7d后分别取叶片,提取总RNA并分离出其中的mRNA,通过锚锭引物O ligo dT10GC反转录和9个10核苷酸随机引物进行PCR扩增。结果DDRT-PCR结果显示,有4个差异DNA片段只在盐胁迫的小麦耐盐品系基因组中表达,而在对照中没有出现。这4个差异cDNA片段分别命名为ts01(260 bp),ts02(330 bp),ts03(420 bp),ts04(600 bp)。4个差异cD-NA片段的RNA杂交结果显示,只有ts04存在明显差异,在盐胁迫条件下有杂交斑点而在对照中没有杂交斑点,其余3个cDNA片段在盐胁迫和对照中都没有杂交斑点。进一步将ts04克隆并进行DNA序列测定及同源性分析。结论ts04可能是耐盐相关cDNA片段,该片段核酸序列与麦属抗性相关的肌动蛋白基因有23%同源。

银染mRNA差异显示方法的条件优化

ｍＲＮＡ差异显示技术是分离差异表达基因的强有力工具。本工作旨在优化无同位素的银染差异显示方法。以总ＲＮＡ为模板，用锚定引物与随机引物的组合进行ＲＴ－ＰＣＲ反应，ＰＣＲ扩增产物在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用银染方法显示电泳ｃＤＡＮ条带，其结果是：（１）ＲＮＡ加入量为１～３μｇ，ＲＴ－ＰＣＲ反应能扩增出较多的ｃＤＮＡ条带，而低于０．５μｇ时扩增条带数目较少；（２）在３６～４２℃的范围内，随着温度的增加，扩增的条带减少；而４２℃时扩增的条带数目锐减，特别是当ＲＮＡ加入量小于１μｇ时几乎无条带显示；３６℃扩增的条带过多而趋于ｓｍｅａｒ；（３）优化了银染液程序，染色液和显色液中３７％甲醛的量分别为０．０３％～０．０５％和０．０７５％～０．１％，显色温度４～１２℃时，显示出清晰的条带；（４）用此方法获得数条电针镇痛有效与无效大鼠表达差异的ｃＤＮＡ条带。总之，通过改变参数条件，优化了快速简便的银染ｍＲＮＡ差异显示方法。