整合mRNA转录本与基因组信息的基因组选择方法研究

基因组预测已成为畜禽、作物遗传评估和人类疾病风险预测的主要技术,但经典的基因组预测方法在性状遗传调控机制等生物学先验信息的整合方面有一定的不足。本研究提出一种将mRNA转录本信息整合应用于复杂性状表型预测的方法。基于国际上广泛应用于数量遗传学研究的果蝇群体,对本研究提出的新方法进行准确性评估。结果显示,整合mRNA转录本,可有效提高部分性状基因组预测准确性,但对部分性状的表型预测准确性没有改善。与GBLUP相比,雄性果蝇D-香芹酮嗅觉反应(dCarvone)准确性由0.256提高到0.274,提高幅度7%。雄性果蝇咖啡因耐受反应(cafe)准确性由0.355提高到0.401,提高幅度13%。雄性果蝇百草枯耐受反应(survival_paraquat)准确性由0.101提高到0.138,提高幅度36%。雌性果蝇1-已醇嗅觉反应(1hexanol)准确性由0.147提高到0.210,提高幅度43%。综上所述,对于部分性状,通过整合mRNA转录本可有效提高基因组预测准确性(提高幅度为7%~43%)。对于部分性状,整合mRNA转录本并考虑互作效应可进一步提高预测准确性。

基于mRNA转录组及sRNA测序技术探讨益肾方干预糖尿病肾病的机制

【目的】探讨益肾方(由黄芪、山茱萸、菟丝子等组成)对糖尿病肾病小鼠肾脏的保护作用机制。【方法】将28只db/db小鼠随机分为模型组,益肾方低、高剂量组和洛汀新组,另外设7只同遗传背景的db/m小鼠为正常组,根据分组灌胃干预12周。观察各组小鼠体质量,生化指标血糖、尿微量白蛋白(MAU)、尿微量白蛋白/肌酐比值(UACR)、胱抑素C(Cys-C),肾间质纤维化相关蛋白神经钙黏蛋白(N-cad)、纤维连接蛋白(FN)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和上皮钙黏蛋白(E-cad)表达水平及肾脏病理改变。应用二代高通量测序技术获取小鼠肾脏组织mRNA转录组及miRNA的表达矩阵,对获得的表达矩阵进行差异基因分析,然后使用R语言、DIANA-miRPath网站分别对差异表达mRNA、miRNA进行基因本体论(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析。【结果】(1)与模型组比较,益肾方低、高剂量组小鼠体质量、UACR、MAU、Cys-C水平降低(P<0.05),血糖无显著性差异(P>0.05),肾脏组织E-cad表达升高、N-cad表达降低(P<0.05),FN、α-SMA无显著性差异(P>0.05),肾脏组织病理损伤减轻。在体质量、血糖、MAU及肾组织E-cad、N-cad、FN、α-SMA表达方面,益肾方低、高剂量组与洛汀新组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。(2)mRNA转录组测序正常组比对模型组共发现293个差异基因,正常组比对益肾方治疗组共有101个差异基因,模型组比对益肾方治疗组共有10个差异基因;各组差异mRNA的GO分析主要富集在炎症反应、脂肪酸代谢、免疫反应相关条目,京都基因与基因组百科全书富集通路主要涉及PPAR信号通路、IL-17信号通路等。sRNA测序正常组比对模型组共6个差异miRNA,其他组未发现差异miRNA,GO富集条目有离子结合、细胞内溶质等,KEGG富集通路NF-κB、Hippo信号通路、细胞外基质受体作用通路。【结论】益肾方可有效改善糖尿病肾病小鼠的生化指标,减轻肾脏病理变化,其肾脏保护作用可能是通过激活PPAR信号通路,抑制IL-17、NF-κB信号通路,从而调节炎症反应、脂代谢、免疫反应来实现的。

雏鸡不同组织TLR1、TLR2、TLR4、TLR5和TLR15 mRNA转录水平相对定量研究

参考GenBank登录的ChTLRs基因序列设计实时定量PCR特异性引物,建立检测鸡Toll样受体(ChTLR)mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析ChTLR1、ChTLR2、ChTLR4、ChTLR5和ChTLR15在雏鸡不同器官组织中的转录水平。结果显示5种ChTLRs在脾脏、法氏囊、胸腺和各段肠道组织中均有转录。其中,ChTLR1 mRNA在法氏囊、肾脏和盲肠组织中转录水平较高;ChTLR2 mRNA在脾脏、法氏囊和肝脏等组织中转录水平较高,在肾脏、肺脏和皮肤未检测到转录;ChTLR4 mRNA在所检测组织中转录水平差异较小,在脾脏、十二指肠和胸腺转录水平较高;ChTLR5 mRNA在肾脏、脾脏和空肠中的转录水平较高;ChTLR15 mRNA在法氏囊中转录水平最高,其次为脾脏和盲肠。本研究建立了检测ChTLRs mRNA在不同器官组织中表达水平的实时定量PCR方法,ChTLRs mRNA在雏鸡各器官组织中转录水平差异较大,可能与雏鸡各器官组织对病原的识别和抵抗能力有关。

PRRS病毒感染对猪细胞因子IL-2、IL-4和IL-10mRNA转录的影响

通过构建猪细胞因子IL 2、IL 4和IL 10的缺失cDNA竞争分子,利用定量竞争PCR技术对猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病毒感染过程中细胞因子IL 2、IL 4和IL 10的mRNA进行转录水平变化的定量检测,研究PRRS病毒感染对猪细胞因子IL 2、IL 4和IL 10mRNA转录的影响。结果表明猪Th1型细胞因子IL 2的mRNA转录水平分别在PRRS病毒感染后1d、28d和56d出现3个mRNA转录高峰;而Th2型细胞因子IL 4的mRNA转录水平在病毒感染后56d内,一直处于低水平,而后才逐渐升高;IL 10的mRNA转录水平在病毒感染后6d内,一直处于低水平状态,第6d后才逐渐上升,至42d到达高峰,而后下降,恢复正常。结果显示PRRS病毒感染可导致Th2型细胞因子IL 4和IL 10基因转录的抑制。

1-2月龄荷斯坦奶牛不同组织中FMDV受体亚基αv、β3、β6mRNA转录水平的相对定量研究

【目的】建立检测牛口蹄疫病毒(FMDV)受体亚基αv、β3、β6 mRNA相对转录水平的实时定量PCR方法,分析受体αvβ3和αvβ6在不同器官组织中的转录水平。【方法】在对牛FMDV受体基因克隆和测序的基础上,设计实时定量PCR引物,以GAPDH为内参基因,采用△△Ct相对定量PCR方法检测分析FMDV受体亚基αv、β3、β6 mRNA在1—2月龄荷斯坦奶牛体内不同器官组织中的转录表达谱。【结果】αvβ3在荷斯坦奶牛24种组织中均有不同程度的转录表达;αvβ6在甲状腺、硬腭、鼻内皮、喉头、肺、食管、肾、后蹄冠状带等组织表达量较高,在唇、舌皮、软腭、气管、心脏、瘤胃、直肠、前蹄冠状带等组织转录表达量适中,在唾液腺、下颌淋巴结、肝、脾、肌肉等组织未检测到表达;αvβ6在牛体内的表达分布与FMDV组织嗜性基本一致,αvβ6受体可能是决定FMDV组织嗜性的主要功能受体,αvβ3的组织分布似乎与FMDV组织嗜性无关,但不能排除αvβ3在病毒感染过程中的作用。【结论】建立了检测FMDV受体亚基mRNA在不同器官组织中表达水平的相对实时定量PCR方法。

雌激素和雄激素对鸡成骨细胞增殖、凋亡、细胞周期及其受体mRNA转录的影响

为探讨雌激素和雄激素对鸡胚额骨成骨细胞(OB)增殖、凋亡、细胞周期及其受体mRNA转录的影响,用雌激素(17β雌二醇)和雄激素(十一酸睾酮)单独以及联合处理鸡胚额骨成骨细胞,MTT法测定细胞增殖率,流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化,荧光定量PCR检测成骨细胞中雌激素受体(ER)及雄激素受体(AR)mRNA的转录。结果显示:一定浓度的雌激素或雄激素在24h内均能促进成骨细胞的增殖,促进成骨细胞的细胞周期进程,但对细胞凋亡无明显作用。雌激素单独或联合雄激素作用能上调ERmRNA的转录,对ARmRNA的转录无明显作用。

rfaE基因在副猪嗜血杆菌LOS刺激猪肺泡巨噬细胞炎性因子mRNA转录中的作用

为研究rfaE基因在副猪嗜血杆菌(HPS)脂寡糖(LOS)刺激猪肺泡巨噬细胞(PAMs)炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α)mRNA转录中的作用,提取HPS SC096株及其rfaE基因缺失株(ΔrfaE)和互补株(cΔrfaE)的LOS,分别用5和10μg HPS-LOS、ΔrfaE-LOS、cΔrfaE-LOS和E.coli-LPS刺激PAMs,分别在2、4、6、12和24h后收集细胞,提取RNA并反转录成cDNA,运用RT-PCR检测IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平。结果表明用5μg HPS-LOS刺激细胞时,2、4、6、12和24h后IL-1αmRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的IL-1αmRNA转录水平(P<0.05),12和24h后IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05),24h后TNF-αmRNA的转录水平升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05);10μg HPS-LOS刺激细胞后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平均升高,显著高于ΔrfaE-LOS刺激细胞后的mRNA转录水平(P<0.05)。同时cΔrfaE-LOS刺激PAMs后IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-αmRNA的转录水平能够恢复到HPSLPS水平。首次证实rfaE基因在HPS LOS刺激PAMs炎性因子mRNA转录水平中起着重要的作用。

扩展莫尼茨绦虫不同体节翻译延伸因子和引发酶mRNA转录水平研究

本研究以β微管蛋白基因作为内参基因,采用实时荧光定量PCR方法检测该基因在扩展莫尼茨绦虫(Moniezia expansa)4个不同发育阶段,即头节、幼节、成节和孕节中的表达差异。标准曲线分析显示,翻译延伸因子、引发酶基因和β微管蛋白基因标准质粒实时定量扩增Ct值与标准质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数(R2)均大于0.99。同时实验结果显示,翻译延伸因子和引发酶基因在虫体各发育阶段中的转录水平存在差异。其中,翻译延伸因子和引发酶基因在扩展莫尼茨绦虫头节和幼节的转录水平均较高,提示这2个基因可能在头节和幼节的发育中有重要作用。

霉变饲料中毒马不同组织中TLR1、TLR2、TLR4和TLR6 mRNA转录水平研究

为探讨霉变饲料中毒马不同组织中TLR1、TLR2、TLR4和TLR6的表达情况,采用SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法检测霉变饲料中毒马和健康对照马胃、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、十二指肠、盲肠和骨髓中TLRs基因的转录水平。结果表明,TLR1、TLR2、TLR4、TLR6基因在检测的胃和肝脏组织中的表达量均是霉变饲料中毒马显著高于对照马(P<0.05),TLR4基因在霉变饲料中毒马所检测的9个组织器官中的表达量均显著高于对照马(P<0.05)。说明霉变饲料中毒可引起马胃和肝脏的主要变化,推测TLR4基因在机体抵御霉变饲料中毒中发挥着重要的作用。

局灶性脑缺血预处理对大鼠NF-κB表达及其靶基因TNFαmRNA转录的影响

目的 观察局灶脑缺血预处理对核因子 -κB(NF-κB)及其靶基因肿瘤坏死因子α(TNFα) m RNA表达的影响 ,并初步探讨二者在诱导脑缺血耐受中的意义。方法 SD大鼠随机分为 3组 ,对照组给予两次相隔 3 d的假手术 ,其余两组分别在 2 h大脑中动脉缺血 (MCAO)及 2 2 h再灌注前 3 d给予 10 min的缺血预处理 (PC)或假手术 ,采用免疫组织化学和逆转录 -多聚酶联反应 (RT-PCR)技术比较各组 NF-κB及 TNFα的表达。结果 预缺血组NF-κB的表达和 TNFα的 m RNA转录水平均低于假手术组 (P<0 .0 1)。结论 10 m in MCAO预处理可有效抑制NF-κB的激活和 TNFα的基因转录 ,NF-κB活化减少以及由此所致的 TNFα表达下调可能是局灶性脑缺血发生耐受的分子机制之一。

硫酸酯化酵母β-葡聚糖对H1N1猪流感病毒血凝作用和mRNA转录的影响

为研究硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及对mRNA转录的影响,以猪流感病毒A/tianjin/1/TJ2(H1N1)感染MDCK细胞为模型,采用血凝抑制试验(HI)及SYBR Green Real-time PCR方法,探索硫酸酯化酵母β-葡聚糖对流感病毒血凝抑制作用及其对mRNA转录影响。结果显示,硫酸酯化酵母β-葡聚糖在浓度超过1.25 mg/m L时,能对猪流感病毒血凝产生抑制作用,且在5 mg/m L时对猪流感病毒mRNA转录具有抑制作用。因此,硫酸酯化酵母β-葡聚糖具有抑制流感病毒在MDCK细胞复制的作用,其作用机制可能与抑制流感病毒HA靶点及影响mRNA转录有关。

RNA聚合酶II中的CTD结构在mRNA转录和加工偶联过程中的重要作用

RNA聚合酶II最大亚基末端的羧基端结构域(CTD)是由以七氨基酸($CTyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-)为重复单位的高度保守的重复序列组成的。因其结构与功能上的特殊性,它在近年来受到学术界的广泛关注。诸多的实验表明,该结构可通过与mRNA加工因子的相互作用而对其加工过程产生直接或间接的影响,在mRNA的转录和加工的偶联过程中具有重要的作用。本文即是根据近年来的实验结果对其结构和功能做出的综述性介绍。

脑C型利钠利尿肽的mRNA转录及其血浆表达水平在大鼠创伤性脑水肿中的改变

目的:观察创伤性脑水肿对脑组织中C型利钠利尿肽(CNP)mRNA转录水平的影响及与其血浆中CNP水平的相关性。方法:35只S-D大鼠随机分入对照组、创伤组。采用冲击加速机制复制重度脑创伤。创伤后1天组的脑CNP mRNA转录水平采用逆转录-多聚酶链反应法(RT-PCR)行半定量测定。并同时采用酶免疫分析法(EIA),观测伤后多时点的体内血浆CNP水平。结果:创伤后1天脑水肿期内,挫伤皮质,同侧丘脑,对侧皮质,对侧丘脑和延髓等部位,与对照组相比,其CNP mRNA转录水平无显著改变(P>0.05)。然而,创伤后1天与3天组血浆的CNP水平均较对照组有明显升高(P<0.05)。结论:尽管CNP一直被认为是一种神经肽,但可能并未参与创伤性脑水肿的病理过程。而全身循环中升高的血浆CNP水平可能为机体对重度脑创伤的反应之一,其作用主要通过循环系统发挥。

PCV-2感染对PK-15细胞IL mRNA转录水平的影响

【目的】观察猪圆环病毒2型(PCV-2)感染对猪肾传代细胞(PK-15细胞)炎性细胞因子白细胞介素(IL)mRNA转录水平的影响,探讨宿主与病毒之间的作用关系及细胞炎性反应机制。【方法】以未感染PCV-2的PK-15细胞为对照组,运用相对定量PCR技术,测定和分析PCV-2感染PK-15细胞后,PCV-2DNA相对含量的变化,以及炎性细胞因子IL-6、IL-8、IL-12p35、IL-12p40、IL-13、IL-17、IL-18mRNA转录水平在1,6,12,24,48,和72h的变化。【结果】PCV-2感染后,PK-15细胞的IL-6、IL-13、IL-17、IL-18的mRNA转录水平在12h显著增加,24h后mRNA转录水平下降;IL-8的mRNA转录水平在48h时最高,为对照组的2.5倍,但72h时恢复至与对照组水平相当;随着感染时间的延长,IL-12p35、IL-12p40的mRNA转录水平显著下降。【结论】PCV-2感染后可引起PK-15细胞中IL-6、IL-8、IL-13、IL-17、IL-18等细胞因子mRNA转录水平增加,而IL-12mRNA转录水平下降,提示PCV-2感染后引起的PK-15细胞炎性反应与其分泌的炎性细胞因子的改变有关。

低剂量辐射增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞的IL-1βDTNFαmRNA转录水平

目的：探讨低剂量辐射（LDR）对荷瘤机体巨噬细胞（Mφ）内白细胞介素I（IL—1）和肿瘤坏死因子（TNF）mRNA转录水平的影响。方法：采用C(57)BL／6J小鼠右后肢腓肠肌内接种Lewis肺癌细胞做为实验动物模型，在荷瘤后10d给予75mGyX射线全身照射，照射后18h冲洗腹腔，用贴壁法分离MФ，应用原位杂交组织化学方法检测MФ内IL—1β和TNFa的mRNA转录水平，结果用病理图像密度扫描仪测定的平均密度值（MA）表示。结果：照射组小鼠的MФ内阳性颗粒数明显增多，染色加深；照射组IL—1β和TNFα阳性颗粒的MA值分别为：0．285士0．005、0．272士0·012，假照组分别为：0．216土0．015、0．204士0．005，二者相比具有显著的差异（P＜0．01）。结论:LDR可明显增高荷瘤小鼠MФ的IL—1β和TNFαmRNA转录水平，促进二者的直接抑瘤和免疫调节效应，从而增强了荷瘤机体的免疫功能和杀灭肿瘤细胞的功能。

人胎肝干细胞的分离培养、鉴定及mRNA转录分析

目的:探讨体外大量扩增培养人胎肝干细胞的方法,研究其形态、特性及mRNA转录情况。方法:采用两步灌流法结合链霉蛋白酶消化及Percoll密度梯度离心法分离12～20周胎龄的胎肝细胞,采用免疫细胞化学染色及RT-PCR方法对分离培养的细胞进行鉴定分析。结果:刚分离的细胞活力在80%以上,原代培养3d开始出现小细胞团,2周后即形成肉眼可见的细胞集落,细胞体积小,核质比大;原代、传代培养的胎肝细胞甲胎蛋白(AFP)、细胞角蛋白19(CK19)、卵圆标记蛋白OV-6、细胞分化抗原34免疫染色阳性;RT-PCR分析证明胎肝干细胞中AFP、白蛋白、CK19、CK18和八聚体结合蛋白(OCT)-4mRNA的表达。结论:分离了胎肝干细胞,具有肝细胞、胆管细胞及干细胞表面标志及相应的基因表达,为进一步的基础研究奠定了基础。

真核mRNA转录终止机制

真核RNA聚合酶II催化的mRNA转录是基因表达中一个重要阶段,但是对它的终止过程却知之甚少。大量实验表明,真核mRNA转录终止涉及到RNA聚合酶II最大亚基(Rpb1)C末端结构域和多种转录终止相关因子以及两者之间的相互作用。这些结果初步勾画了真核mRNA转录终止的一般过程。

慢性心力衰竭患者外周单核细胞TNF-α mRNA转录和蛋白质表达的改变

目的 :通过测定慢性充血性心力衰竭 (CHF)患者外周单核细胞肿瘤坏死因子 (NTF α)mRNA转录和蛋白质表达的改变 ,探讨TNF α在慢性充血性心力衰竭发病中的作用 ,及可能来源。方法 :应用RT PCR和Westernblot技术测定 2 0例CHF患者和 10例正常对照组外周单核细胞TNF αmRNA转录和蛋白质表达的变化。结果 :与正常对照组相比 ,慢性充血性心力衰竭 (CHF)患者外周单核细胞TNF αmRNA转录水平 ,TNF α蛋白质表达的相对含量高于对照组 (P <0 0 1)。结论 :提示TNF α可能参与了心力衰竭的发生发展过程。PBMC可能是心力衰竭时TNF

猪脑心肌炎病毒感染对iNOS mRNA转录水平的影响

为研究iNOS在猪脑心肌炎病毒(EMCV)致病机制中的作用,本研究将猪源EMCV GXLC株人工感染小鼠、仔猪,观察临床症状和病理变化,检测心、脑组织中iNOS mRNA转录水平。试验结果表明,小鼠和仔猪感染EMCV后均出现明显的临床症状、剖检及组织病理学变化显示心、脑组织的病理炎症分值显著增加;心、脑组织中的iNOS mRNA转录水平显著上调,并且转录水平上调的峰值与感染小鼠、仔猪出现明显临床症状、严重病理损害及小鼠死亡高峰存在明显的时间相关性,与心、脑组织的病理炎症分值成线性正相关。表明组织中iNOS的过量表达与感染动物的发病和死亡密切相关,iNOS在EMCV致病机制中发挥重要作用。

扩展莫尼茨绦虫不同体节CREB和PICK基因mRNA转录水平研究

为研究CREB和PICK在扩展莫尼茨绦虫不同体节的mRNA转录水平,以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR方法检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异。标准曲线分析显示,CREB、PICK基因和beta-Tubulin基因标准质粒实时定量扩增Ct值与标准质粒的质量浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99;熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时结果还显示,CREB以及PICK基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异。CREB基因在扩展莫尼茨绦虫头颈节、幼节、成节和孕节的表达水平依次呈上升趋势,而PICK基因在扩展莫尼茨绦虫成节以及孕节的表达水平较高。