miR-582-5p靶向调控FOXO1对新生大鼠缺血缺氧性脑病神经元损伤的影响

目的 探讨微小RNA-582-5p(miR-582-5p)靶向调控叉头框转录因子1(FOXO1)对新生大鼠缺血缺氧性脑病(HIE)神经元损伤的影响。方法 90只新生大鼠按照随机数字表法均分为对照(NC)组、模型(HIE)组、miRNA对照(LV-miRNA-NC)组、miR-582-5p过表达(LV-miR-582-5p)组、miR-582-5p过表达+mRNA对照(LV-miR-582-5p+LV-NC)组、miR-582-5p过表达+FOXO1过表达(LV-miR-582-5p+LV-FOXO1)组。除NC组外的各组大鼠建立HIE模型,对大鼠进行神经功能缺损评分,TTC染色测定脑梗死体积,Real-time PCR检测miR-582-5p和FOXO1表达,双萤光素酶报告基因实验检测miR-582-5p和FOXO1靶向关系,HE染色观察海马组织病理变化,TUNEL和Neu N荧光双标共定位检测海马组织神经元凋亡,免疫组化染色检测FOXO1、胱天蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达。结果miR-582-5p和FOXO1具有靶向关系,与NC组比较,HIE组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达增加,miR-582-5p表达降低,海马组织出现病理损伤(P<0.05);与LVmiRNA-NC组比较,LV-miR-582-5p组大鼠神经功能缺损评分、脑梗死体积、FOXO1表达、神经元凋亡率、FOXO1、Caspase-3蛋白表达降低,miR-582-5p表达增加,海马组织病理损伤好转(P<0.05);LV-FOXO1可以逆转LV-miR-582-5p对于HIE大鼠神经元损伤的保护作用。结论 miR-582-5p可以直接靶向负调控FOXO1表达,减少HIE新生大鼠神经元凋亡,对神经损伤具有保护作用。

血清miR-181c-5p和miR-582-5p水平在老年急性缺血性脑卒中早期诊断中的应用

目的探讨血清miR-181c-5p、miR-582-5p在老年急性缺血性脑卒中(AIS)早期诊断中的应用。方法选取2019年3月至2021年3月成都市第六人民医院神经内科治疗的89例老年AIS患者为AIS组,根据NIHSS评分将患者分为重度组24例、中度组34例、轻度组31例。另选取同期到本院就诊并确诊为无神经功能障碍、无梗死病灶的一般脑血管疾病患者60例为对照组。采用qRT-PCR检测血清miR-181c-5p、miR-582-5p表达水平;Spearman法分析老年AIS患者血清miR-181c-5p、miR-582-5p水平与NIHSS评分的相关性;Logistic回归分析老年AIS发生的影响因素;ROC曲线分析血清miR-181c-5p、miR-582-5p水平对老年AIS的诊断价值。结果与对照组相比,AIS组血清miR-181c-5p显著升高(P<0.05),血清miR-582-5p显著降低(P<0.05)。老年AIS患者血清miR-181c-5p水平与NIHSS评分呈正相关(r=0.676,P<0.001),血清miR-582-5p水平与NIHSS评分呈负相关(r=-0.656,P<0.001);随病情程度增加,血清miR-181c-5p水平逐渐升高,miR-582-5p水平逐渐降低(P<0.05)。miR-181c-5p是影响老年AIS发生的危险因素,miR-582-5p是保护因素(P<0.05)。血清miR-181c-5p、miR-582-5p以及两者联合诊断老年AIS的AUC分别为0.893、0.803、0.938,联合诊断的敏感度为88.80%,特异性为85.00%,两者联合优于血清miR-181c-5p、miR-582-5p各自单独诊断(P=0.022、P<0.001)。结论老年AIS患者血清miR-181c-5p水平上调,miR-582-5p水平下调,为早期诊断老年AIS及判断病情严重程度的标志物,两者联合诊断老年AIS具有较高效能。

CircSMC3调节miR-582-5p/MCL1轴对胃癌细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的:探讨环状非编码RNA(CircRNA)SMC3通过调节微小RNA(miR)-582-5p/髓细胞白血病基因1(MCL1)轴对胃癌(GC)细胞增殖、凋亡和迁移的影响。方法:qRT-PCR检测4种GC细胞系及正常胃上皮细胞系GES-1中SMC3、miR-582-5p、MCL1mRNA的表达水平。将SGC-7901细胞分为对照组、si-NC组、si-SMC3组、mimics NC组、miR-582-5p组、si-SMC3+inhibitor NC组、si-SMC3+miR-582-5p inhibitor组、miR-582-5p+pcDNA3.1组、miR-582-5p+MCL1组。检测各细胞凋亡、增殖、迁移及相关蛋白表达的情况;验证miR-582-5p与SMC3、MCL1的靶向关系。结果:4种GC细胞系中SMC3、MCL1 mRNA表达均增加,miR-582-5p表达下降(P<0.05)。干扰SMC3、过表达miR-582-5p可以抑制SGC-7901细胞增殖、迁移及相关蛋白、表达(P<0.05);抑制miR-582-5p表达可逆转干扰SMC3对细胞的作用(P<0.05);上调MCL1可逆转过表达miR-582-5p细胞的作用(P<0.05)。结论:干扰SMC3可能通过调节miR-582-5p/MCL1轴,抑制SGC-7901细胞增殖、迁移,促进凋亡。

LncRNA NNT-AS1通过miR-582-5p/MCL1对肝癌细胞侵袭和转移的影响

目的探讨LncRNA NNT-AS1通过miR-582-5p/MCL1轴对肝癌的侵袭和转移的影响。方法培养正常肝L-02细胞和肝癌细胞MHCC97H、LM3、SMCC7721、Huh7、Hep3B,选取肝癌Huh7细胞系,将细胞进行分组与转染;采用qRT-PCR检测各组细胞中NNT-AS1、miR-582-5p表达,WB检测各组细胞MCL1蛋白表达,RIP检测LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p的结合情况,双荧光素酶报告基因实验验证miR-582-5p和MCL1靶向关系,Transwell实验检测细胞侵袭和转移能力。结果与正常肝细胞L-02比较,NNT-AS1在肝癌细胞系中高表达,miR-582-5p在肝癌细胞系中低表达;NNT-AS1和miR-582-5p沉默后,细胞中NNT-AS1和miR-582-5p表达显著降低,细胞侵袭和转移能力也明显减弱;LncRNA NNT-AS1可结合吸附miR-582-5p,MCL1是miR-582-5p的下游靶基因、且MCL1在肝癌细胞系中高表达;干扰LncRNA NNT-AS1或过表达miR-582-5p表达可抑制肝癌细胞侵袭和迁移;同时沉默NNT-AS1和过表达miR-582-5p,可显著降低细胞侵袭和迁移能力;干扰MCL1也可抑制肝癌细胞侵袭和迁移能力增强的现象。结论沉默LncRNA NNT-AS1可通过miR-582-5p作用,抑制MCL1表达从而抑制肝癌细胞侵袭和转移。

LncRNA UCA1靶向miR-582-5p调控缺血低氧性脑神经细胞存活的实验研究

目的 观察长链非编码RNA尿路上皮癌胚抗原1 (LncRNA UCA1)在大脑中动脉阻塞(MCAO)大鼠模型、氧糖剥夺/复氧(OGD/R) PC12细胞中的表达,探究其调控脑神经细胞增殖、凋亡的潜在机制。方法 MCAO法建立大鼠缺血再灌注损伤模型;OGD/R法制作PC12细胞损伤模型。shcon、sh-UCA1给予大鼠右脑室注射;脂质体法转染si-con、si-UCA1、agomiRNA、agomiR-582-5p、siUCA1+antagomiRNA、si-UCA1+antagomiR-582-5p至PC12细胞。荧光逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)实验检测组织、细胞中LncRNA UCA1、miR-582-5p表达;DNA末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测脑组织神经元凋亡;细胞计数(CCK8)实验、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)染色、克隆形成实验检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因检测实验检测细胞荧光活性。结果 与空白组相比,模型组大鼠脑组织LncRNA UCA1升高,TUNEL凋亡率升高,shUCA1给药组大鼠脑组织LncRNA UCA1降低,TUNEL凋亡率也降低(P<0.05)。与对照组相比,OGD/R组细胞LncRNA UCA1升高,细胞增殖率、EdU阳性率、克隆形成数均降低,凋亡率升高,转染si-UCA1的细胞LncRNA UCA1降低,细胞增殖率、EdU阳性率、克隆形成数均升高,凋亡率降低(P<0.05);LncRNA UCA1直接靶向负调控miR-582-5p,且在大鼠脑组织中miR-582-5p的水平与LncRNA UCA1呈负相关性(R^(2)=0.249,P<0.05)。miR-582-5p在模型组大鼠脑组织、OGD/R细胞中均低表达(P<0.05);与agomiRNA组相比,agomiR-582-5p组细胞miR-582-5p表达升高,细胞增殖率、EdU阳性率、克隆形成数均升高,凋亡率降低(P<0.05)。抑制miR-582-5p减弱敲减LncRNA UCA1对OG D/R细胞的增殖促进和凋亡抑制作用。结论LncRNA UCA1参与缺血低氧性脑神经细胞的损伤过程,抑制OGD/R PC12细胞增殖,促进凋亡,这种不利于神经细胞存活的作用与靶向miR-582-5p有关。

LncRNANNT-AS1通过调控miR-582-5p/NCKAP1轴激活Hippo-YAP/TAZ信号通路促进膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭和干细胞干性影响

目的检测膀胱癌中长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)烟酰胺核苷酸转氢酶反义RNA1(nicotinamide nucleotide transhydrogenase antisense RNA 1,NNT-AS1)表达情况,研究其对膀胱癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响及可能分子机制。方法实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测膀胱癌组织标本及细胞中LncRNA NNT-AS1表达情况;将膀胱癌细胞转染分为sh-NC组,sh-NNT-AS1组,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组和sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组。采用CCK-8法检测细胞增殖吸光度值(A值);Transwell实验检测细胞迁移、侵袭穿膜数;细胞成球实验检测干细胞干性。检索starBase和TargetScan数据库,并通过双荧光素酶报告基因实验预测验证LncRNA NNT-AS1和miR-582-5p,miR-582-5p与NCKAP1的靶向结合关系。Western blot检测膀胱癌干细胞标志蛋白(CD44,ALDH1A1,Oct4,Nanog)及Hippo-YAP/TAZ信号通路相关蛋白表达灰度值。结果与癌旁组织相比,膀胱癌组织中LncRNA NNT-AS1表达水平(0.34±0.07 vs 1.15±0.21)明显升高,差异有统计学意义(t=16.364,P<0.001)。与人正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞(1.00±0.01)相比,膀胱癌细胞T24,5637,UM-UC-3和TCC-SUP中LncRNA NNT-AS1表达(6.03±0.17,4.66±0.36,5.47±0.26,3.02±0.20)明显升高,差异有统计学意义(t=17.472~51.160,均P<0.001)。与sh-NC组相比,在24,48和72 h时sh-NNT-AS1组细胞增值能力(A值)均显著降低(0.80±0.01 vs 1.07±0.06,1.18±0..07 vs 1.83±0.03,1.89±0.07 vs 2.53±0.06),差异有统计学意义(t=7.688,14.783,12.024,均P<0.05);sh-NNT-AS1组细胞迁移穿膜数(55.00±2.65个vs 354.30±7.84个)、细胞侵袭穿膜数(45.67±2.33个vs 303.00±9.07个)及膀胱癌干细胞成球数(20.85±2.17个vs 41.35±3.67个)显著降低,差异具有统计学意义(t=-62.641,-47.596,8.328,均P<0.001)。与sh-NC组相比,sh-NNT-AS1组细胞中CD44(0.04±0.01 vs 1.12±0.02),ALDH1A1(0.23±0.01 vs 1.16±0.05),Oct4(0.17±0.02 vs 1.10±0.04),Nanog(0.49±0.03 vs 1.24±0.03)的蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=83.656,31.591,36.019,30.619,均P<0.001)。与si-NC组相比,sh-NNT-AS1组CD44+CD133+细胞比例(9.30%±0.79%vs 88.50%±2.77%)明显降低,差异有统计学意义(t=-47.624,P<0.001)。双荧光素酶报告基因检测结果显示miR-582-5p为LncRNANNT-AS1靶基因,NCKAP1为miR-582-5p靶基因;LncRNA NNT-AS1靶向调控miR-582-5p/NCKAP1轴。与sh-NNT-AS1组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞增值能力(A值)均明显升高(0.98±0.03 vs 0.73±0.06,1.74±0.04 vs 1.22±0.05,2.33±0.16 vs 1.69±0.14),差异有统计学意义(t=5.977~11.628,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,在24,48,72 h时sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞增值能力(A值)显著降低(0.69±0.04,1.01±0.07,1.39±0.08),差异有统计学意义(t=7.877~16.323,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞迁移穿膜数(322.31±28.45个vs 81.42±13.22个)、细胞侵袭穿膜数(316.07±30.21个vs 92.13±12.65个)及膀胱癌干细胞成球数(38.55±2.20个vs 18.98±1.16个)显著增加,差异具有统计学意义(t=15.115,13.158,14.592,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p组细胞CD44(1.05±0.08 vs 0.10±0.01),ALDH1A1(1.20±0.16 vs 0.22±0.02),Oct4(1.32±0.14 vs 0.19±0.03),Nanog(0.97±0.12 vs 0.15±0.04),YAP(1.29±0.11 vs 0.42±0.07)和TAZ(1.41±0.16 vs 0.35±0.05)蛋白表达灰度值均显著增加,差异具有统计学意义(t=10.650~21.243,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞迁移穿膜数(65.33±12.60个)、细胞侵袭穿膜数(71.08±15.19个)、膀胱癌干细胞成球数(11.36±1.05个)均显著降低,差异具有统计学意义(t=16.125,14.395,21.365,均P<0.001)。与sh-NNT-AS1+inh-582-5p组相比,sh-NNT-AS1+inh-582-5p+si-NCKAP1组细胞CD44(0.25±0.05),ALDH1A1(0.61±0.11),Oct4(0.22±0.08),Nanog(0.44±0.07),YAP(0.25±0.09)和TAZ(0.30±0.04)蛋白表达灰度值显著降低,差异具有统计学意义(t=6.412~17.889,均P<0.001)。结论膀胱癌中LncRNA NNT-AS1表达上调,其对膀胱癌细胞增殖、侵袭及肿瘤干细胞干性的影响,可能是通过调控miR-582-5p/NCKAP1分子轴,激活Hippo-YAP/TAZ信号通路完成。

长链非编码RNA UCA1靶向miR-582-5p对膀胱癌UM-UC-3细胞生存和运动能力的调节作用及机制研究

目的:探究长链非编码RNA UCA1通过靶向miR-582-5p对膀胱癌细胞生存和运动能力的作用及作用机制。方法:用UCA1 shRNA(sh-UCA1)和(或)miR-582-5p inhibitor转染细胞,荧光定量检测转染效率及miR-582-5p的表达水平;荧光素酶报告实验确定UCA1和miR-582-5p的靶向关系;CCK8检测细胞活性,流式检测细胞凋亡情况,侵袭及划痕实验检测细胞侵袭迁移能力,免疫印迹检测细胞增殖、凋亡及迁移相关蛋白的表达。结果:sh-UCA1能显著降低膀胱癌细胞UCA1表达水平(P<0.05),促进miR-582-5p表达(P<0.05);miR-582-5p inhibitor能明显减弱sh-UCA1对miR-582-5p表达的促进作用(P<0.05);荧光素酶报告实验表明UCA1上有miR-582-5p的结合位点;沉默UCA1可显著抑制膀胱癌细胞增殖及Ki67的表达,促进细胞凋亡及cleaved caspase-3的表达(P<0.05);同时,sh-UCA1还能显著抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移及VEGF的表达(P<0.05);此外,miR-582-5p inhibitor可显著减弱sh-UCA1对细胞增殖、凋亡及侵袭迁移能力的作用(P<0.05)。结论:UCA1可通过靶向miR-582-5p增强膀胱癌UM-UC-3细胞的生存及运动能力。

miR-582-5p通过诱导EMT抑制胃癌细胞的侵袭转移

目的 探讨miR-582-5p对胃癌细胞侵袭迁移的影响,并初步探讨其分子机制。方法 使用miR-582-5p mimics转染胃癌SGC-7901和AGS细胞,real-time PCR验证转染率。后续实验分为实验组(转染miR-582-5p mimics)和空白对照组(转染negative control),Transwell和细胞划痕实验检测上调miR-582-5p对SGC-7901和AGS细胞侵袭、迁移的作用;real-time PCR和Western blotting检测上调miR-582-5p后对上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)基因Slug、Snail、vimentin、fibronectin和E-cadherin的影响。Dickkopf-1阻断Wnt/β-catenin信号通路后观察上调miR-582-5p对SGC-7901和AGS细胞侵袭的影响。结果 转染miR-582-5p mimics的SGC-7901和AGS细胞miR-582-5p的表达较胃黏膜细胞表达显著降低(均 P <0.05)。上调miR-582-5p后SGC-7901和AGS细胞的侵袭、迁移能力显著降低;上调miR-582-5p后SGC-7901和AGS细胞中Slug、Snail、vimentin及fibronectin蛋白的表达显著降低,E-cadherin表达显著增高(均 P <0.05)。Dickkopf-1减弱了上调miR-582-5p对SGC-7901和AGS细胞的侵袭的抑制作用。结论 胃癌细胞上调miR-582-5p后可能通过诱导EMT降低细胞侵袭、迁移能力,这可能和Wnt/β-catenin激活有关。

miR-582-5p靶向PDCD10对胃癌细胞迁移、侵袭及凋亡的影响

目的探讨微小RNA(miR)-582-5p靶向程序性细胞死亡因子10(PDCD10)对胃癌细胞迁移、侵袭、凋亡的影响。方法常规培养人正常胃黏膜上皮细胞株(GES-1)、胃癌细胞系(HGC-27、MKN74、NUGC-4),用qPCR法检测细胞中miR-582-5p表达,筛选miR-582-5p表达最低的HGC-27作为实验细胞。将对数生长期的HGC-27随机分为8组,各组采用脂质体转染法分别转染miR-582-5p模拟物(使miR-582-5p过表达)、miR-582-5p抑制剂(使miR-582-5p低表达)、miR-582-5p模拟物阴性对照miR-NC、miR-582-5p抑制剂阴性对照anti-miR-NC、PDCD10小干扰RNA si-PDCD10(使PDCD10低表达)、PDCD10小干扰RNA阴性对照si-NC、PDCD10过表达载体pcDNA-PDCD10(使PDCD10过表达)、过表达载体阴性对照pcDNA-NC。用qPCR法检测细胞内miR-582-5p、PDCD10 mRNA表达,证实转染成功。用Western blotting法检测细胞内PDCD10、活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达,用流式细胞术测算细胞凋亡率,用Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭能力,用双荧光素酶报告基因检测法验证miR-582-5p与PDCD10的靶向调控关系。结果与miR-NC组比较,miR-582-5p组Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量高,MMP2、MMP9蛋白相对表达量低,细胞凋亡率高,细胞迁移数、侵袭数少(P均<0.05)。与si-NC组比较,Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量低,MMP2、MMP9蛋白相对表达量高,细胞凋亡率低,细胞迁移数、侵袭数多(P均<0.05)。miR-582-5p与PDCD10的3′UTR存在靶向结合位点。miR-582-5p与WT-PDCD10报告质粒共转染HGC-27后的荧光素酶活性低于miR-NC与WT-PDCD10报告质粒共转染(P<0.05);miR-582-5p或miR-NC与MUT-PDCD10报告质粒共转染HGC-27后的荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05)。与miR-NC组比较,miR-582-5p组PDCD10蛋白相对表达量低(P<0.05);与anti-miR-NC组比较,anti-miR-582-5p组PDCD10蛋白相对表达量高(P<0.05)。与miR-582-5p+pcDNA-NC组比较,miR-582-5p+pcDNA-PDCD10组Cleaved-caspase-3蛋白相对表达量低,MMP2、MMP9蛋白相对表达量高,细胞凋亡率低,细胞迁移数、侵袭数多(P均<0.05)。结论miR-582-5p可通过靶向抑制PDCD10表达诱导胃癌细胞凋亡,抑制细胞迁移、侵袭。

miR-582-5p通过调控Wnt通路影响胃癌AGS细胞的增殖和耐药

目的观察micro RNA-582-5p(miR-582-5p)对人胃癌细胞AGS增殖和耐药功能的影响,探讨其分子机制。方法miR-582-5p mimics通过脂质体转染人胃癌AGS细胞(实验组),同时设置阴性对照组(转染Negative Control)和空白对照组(untreated cell)。实时荧光定量PCR、MTT法、流式细胞技术分别检测转染3组细胞后miR-582-5p的表达变化、增殖能力、药物敏感性、细胞周期;Target Scan Human网站预测LGR5基因可能是miR-582-5p的靶基因之一,并用双荧光素酶报告载体验证其靶基因;Western blot检测3组细胞中cyclin D1、c-myc、survivin和LGR5蛋白的表达。结果相比阴性对照组和空白对照组,实验组中AGS细胞增殖能力下降,在第72,96小时生长速度明显抑制,差异有统计学意义(P<0.05)。相比阴性对照组和空白对照组,实验组细胞周期被抑制,G_0/G_1期细胞比例明显增多(P<0.05),S期细胞比例减少(P<0.05),细胞对奥沙利铂的敏感性增强,耐药性降低(P<0.05)。相比阴性对照组和空白对照组,实验组含有LGR5基因的3'UTR荧光素酶活性明显得到抑制,而且Wnt通路下游靶基因cyclin D1、c-myc、survivin和LGR5蛋白表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 miR-582-5p在胃癌细胞中可作为抑癌因子调控胃癌细胞增殖能力、化疗药物奥沙利铂耐药性、细胞周期变化,并通过下调LGR5调控Wnt信号通路,推测miR-582-5p和胃癌的发生和发展有关。

miR-582-5p在唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移中的作用

目的 :探讨micro RNA-582-5p(miR-582-5p)对唾液腺腺样囊性癌侵袭、转移能力的调控作用。方法 :通过q PCR验证腮腺腺样囊性癌与正常组织中miR-582-5p的表达水平差异,以唾液腺腺样囊性癌肺转移细胞株SACC-83为实验对象,通过脂质体介导,将miR-582-5p的拟似物(miR-582-5p mimics)转染至SACC-83细胞,升高miR-582-5p的表达水平。采用荧光实时定量PCR(RT-PCR)检测转染前、后SACC-83中miR-582-5p的表达变化,通过Transwell实验检测细胞侵袭、迁移能力的改变,通过荧光素酶报告实验验证靶基因,Western印迹检测miR-582-5p的靶基因整合素FOXC1的表达变化,免疫组织化学检测FOXC1在癌与正常组织中的差异表达,应用SPSS 16.0软件包对所得数据进行t检验或单因素方差分析。结果:miR-582-5p在唾液腺腺样囊性癌组织中低表达,在正常组织中高表达。转染miR-582-5p mimics后的SACC-83中,miR-582-5p的表达显著上调(P<0.001),SACC-83细胞的侵袭迁移能力显著降低(P<0.001)。Western印迹检测结果显示,在SACC-83中升高miR-582-5p的表达水平后,FOXC1表达显著降低。FOXC1在唾液腺腺样囊性癌组织中高表达,在正常组织中低表达。结论 :低表达miR-582-5p有助于维持腺样囊性癌的侵袭、转移特性;调高其表达水平,能有效抑制SACC-83的侵袭、迁移能力。miR-582-5p可能通过调控其靶基因FOXC1的表达而发挥作用。

miR-582-5p靶向DNMT1对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨微小RNA-582-5p(miR-582-5p)对DNA甲基转移酶1(DNMT1)的靶向作用及对人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)和蛋白质印迹法(Western Blot)检测瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFB)和正常皮肤成纤维细胞(NFB)miR-582-5p、DNMT1 mRNA、DNMT1蛋白表达。starBase网站与双荧光素酶报告实验分析miR-582-5p与DNMT1的靶向关系。瘢痕疙瘩成纤维细胞中转染miR-582-5p或si-DNMT1,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western Blot检测DNMT1、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、p21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。miR-582-5p和pcDNA-DNMT1共转染,观察DNMT1过表达对miR-582-5p过表达诱导的瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡的影响。结果与NFB组比较,KFB中miR-582-5p表达量明显减少(P<0.05),DNMT1 mRNA和DNMT1蛋白表达量显著增加(P<0.05)。miR-582-5p靶向调控DNMT1的表达。miR-582-5p过表达或抑制DNMT1表达明显抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表达(P<0.05),显著促进细胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表达(P<0.05)。DNMT1过表达逆转miR-582-5p过表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、CyclinD1蛋白、Bcl-2蛋白表达的抑制作用,以及对细胞凋亡、p21蛋白、Bax蛋白表达的促进作用。结论miR-582-5p通过靶向调控DNMT1的表达抑制人瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,并诱导其凋亡。

非小细胞肺癌组织中miR-582-5p、Rab27a的表达变化及与临床病理参数的关系

目的研究非小细胞肺癌(NSCLC)癌组织中miR-582-5p及RAS癌基因家族Rab27a的表达及与临床病理参数的关系。方法应用荧光实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测120例NSCLC癌组织和瘤旁组织中miR-582-5p、Rab27a的表达,蛋白质免疫印迹法检测组织中Rab27a蛋白表达,统计学分析组间miR-582-5p与Rab27a的表达差异及与临床病理特征之间的关系。结果与癌旁组织比较,NSCLC癌组织中miR-582-5p表达明显较低,而Rab27a表达明显较高(均P<0.05)。与TNM分期Ⅰ~Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织比较,TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、伴淋巴结转移患者癌组织中miR-582-5p表达较低,而Rab27a表达较高(均P<0.05)。癌组织中miR-582-5p与Rab27a表达呈负相关(r=-0.633,P=0.000)。结论NSCLC癌组织中miR-582-5p表达降低,而Rab27a表达升高,两者有可能成为NSCLC诊断、治疗方面新的分子标志物。

miR-582-5p调控Notch1减轻心肌缺血再灌注损伤的研究

目的 检测小鼠心肌缺血再灌注和HL-1细胞HR模型后miR-582-5p和Notch1在其中的表达变化,以此探讨miR-582-5p调控Notch1保护心肌的作用。方法 通过建立小鼠心肌缺血再灌注模型和HL-1细胞氧糖剥夺再复氧模型,使用qPCR检测miR-582-5p和Notch1在小鼠IR和细胞HR后的表达量,继而使用TargetScan网站预测miR-582-5p和Notch1的靶向结合位点,在细胞中转染miR-582-5p和Notch1的Inhibitor和Mimics,再次检测miR-582-5p和Notch1的表达变化,最后使用CCK-8实验检测HL-1细胞转染Inhibitor和Mimics后的细胞活力。结果在小鼠IR和HL-1细胞HR后,miR-582-5p表达明显升高(P <0.01),Notch1表达显著下降(P <0.001),而在转染Inhibitor后,miR-582-5p明显下调(P <0.001),同时Notch1显著上调(P=0.017),并且心肌细胞活力得到显著提高(P=0.006),而在转染Mimics后结果完全相反。结论 miR-582-5p可以通过调控Notch1从而保护心肌以此来对抗心肌缺血缺氧。

干扰lncRNA SBF2-AS1通过靶向调控miR-582-5p表达抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭

目的:探讨lncRNA SBF2-AS1对乳腺癌细胞恶性生物学行为的影响及其分子机制。方法:乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231和正常乳腺细胞MCF10A用RPMI-1640培养基常规培养;取对数生长期乳腺癌细胞MCF-7,分别将miR-582-5p模拟物及阴性对照(NC)、SBF2-AS1干扰表达载体(siRNA)及阴性对照转染至MCF-7细胞,记为miR-582-5p组、miR-NC组、si-SBF2-AS1组、si-NC组;将SBF2-AS1干扰表达载体分别与miR-582-5p抑制剂及阴性对照共转染至MCF-7细胞,记为siSBF2-AS1+miR-582-5p组、si-SBF2-AS1+anti-miR-NC组。实时荧光定量PCR(qPCR)检测正常乳腺细胞MCF10A和乳腺癌细胞系MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231中SBF2-AS1和miR-582-5p的表达水平;MTT法检测MCF-7细胞活性;Transwell检测MCF-7细胞迁移和侵袭数目;双荧光素酶报告基因实验检测SBF2-AS1和miR-582-5p的靶向关系。结果:与正常乳腺细胞HCC1937相比,乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3、MDA-MB-231中SBF2-AS1的表达水平显著升高,miR-582-5p的表达水平显著降低(均P<0.05)。干扰SBF2-AS1表达或过表达miR-582-5p后,MCF-7细胞活性显著降低,MCF-7细胞中迁移和侵袭数量显著降低(均P<0.05)。SBF2-AS1可靶向调控miR-582-5p的表达。抑制miR-582-5p表达可部分逆转干扰SBF2-AS1表达对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移和侵袭的作用。结论:干扰lncRNA SBF2-AS1可通过上调miR-582-5p抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、迁移和侵袭。

miR-582-5p通过靶向SOCS1基因调节皮肤黑色素瘤细胞迁移、侵袭和EMT的机制研究

目的研究微小RNA-582-5p(miR-582-5p)对细胞因子信号转导抑制因子1(SOCS1)基因的靶向关系及对皮肤黑色素瘤细胞迁移、侵袭和上皮间充质转化(EMT)的影响。方法实时荧光定量PCR(qPCR)检测人黑色素瘤细胞株A375、G361、WM35、M14和人类皮肤黑色素细胞NHEM中miR-582-5p、SOCS1 mRNA表达,蛋白质印迹法(Western blot)检测SOCS1蛋白表达。构建miR-582-5p过表达的A375细胞,噻唑蓝(MTT)和流式细胞术分别检测细胞增殖与凋亡,Transwell小室法检测细胞迁移和侵袭,Western blot检测N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达,生物信息学结合双荧光素酶报告实验分析miR-582-5p和SOCS1的靶向关系。miR-582-5p和pcDNA-SOCS1共转染入A375细胞,评价过表达SOCS1对miR-582-5p过表达诱导的细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭和EMT的影响。结果与NHEM细胞相比,A375、G361、WM35、M14细胞中miR-582-5p表达明显降低(P<0.05),SOCS1 mRNA和SOCS1蛋白表达显著提高(P<0.05)。miR-582-5p过表达明显降低A375细胞48 h、72 h的细胞活性、迁移细胞数、侵袭细胞数、N-cadherin、Vimentin蛋白表达(P<0.05),显著提高细胞凋亡率、E-cadherin蛋白表达(P<0.05)。miR-582-5p靶向调控SOCS1的表达。过表达SOCS1逆转了miR-582-5p过表达对A375细胞增殖、迁移、侵袭、SOCS1、N-cadherin和Vimentin蛋白表达的抑制作用,及对细胞凋亡、E-cadherin蛋白表达的促进作用。结论miR-582-5p直接靶向SOCS1调控皮肤黑色素瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡和EMT过程。

miR-582-5p靶向抑制Rab27a对肺癌细胞生物学行为的影响

目的探讨microRNA-582-5p(miR-582-5p)在非小细胞肺癌(NSCLC)中表达及其对A549细胞增殖、侵袭的影响,以及对Rab27a基因的靶向调控作用。方法采用实时荧光定量PCR(QPCR)检测33例行手术治疗的NSCLC患者的癌组织、对应癌旁组织以及A549细胞株、人正常支气管肺上皮细胞株BEAS-2B中miR-582-5p的表达水平。采用miR-582-5p inhibitor(anti-miR-582-5p)和miR-582-5p mimics(mim-miR-582-5p)转染A549细胞,另分别转染miRNA inhibitor无关系列(antiNC)和miRNA mimics无关系列(mim-NC)作阴性对照。采用双荧光素酶报告实验验证Rab27a与miR-582-5p的关系。采用MTT法和Transwell小室法检测各组细胞增殖、侵袭能力;采用QPCR和Western blotting检测各组A549细胞中Rab27a mRNA和蛋白水平。结果 NSCLC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达水平分别为0. 26±0. 09和0. 83±0. 10; A549细胞株和BEAS-2B细胞株中miR-582-5p表达水平分别为0. 63±0. 08和1. 17±0. 09,差异均有统计学意义(P<0. 05)。anti-miR-582-5p组A549细胞24、48、72、96 h后的增殖率分别为(115. 68±4. 34)%、(130. 48±5. 48)%、(138. 95±5. 55)%、(147. 03±5. 69)%,明显高于anti-NC组; mim-miR-582-5p组A549细胞24、48、72、96 h后的增殖率分别为(91. 31±4. 18)%、(86. 74±3. 23)%、(79. 45±3. 20)%、(75. 22±4. 09)%,明显低于mim-NC组,差异均有统计学意义(P<0. 05)。Transwell小室结果显示,anti-miR-582-5p组A549细胞侵袭数为189±19,明显高于anti-NC组; mim-miR-582-5p组A549细胞侵袭数为55±8,明显低于mim-NC组,差异均有统计学意义(P<0. 05)。miR-582-5p可抑制野生型Rab27a 3’-UTR报告基因载体的荧光素酶活性,而对突变型Rab27a 3’-UTR的荧光素酶活性无影响。anti-miR-582-5p组A549细胞Rab27a mRNA和蛋白表达水平分别为2. 01±0. 29和0. 85±0. 12,高于anti-NC组; mimi-miR-582-5p组A549细胞Rab27a mRNA和蛋白表达水平分别为0. 35±0. 08和0. 21±0. 05,明显低于mim-NC组,差异均有统计学意义(P<0. 05)。结论上调miR-582-5p表达可抑制Rab27a表达,从而抑制肺癌A549细胞增殖、侵袭活性,miR-582-5p有望成为肺癌新的治疗靶点。

miR-582-5p靶向调控AKT3对甲状腺乳头状癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨miR-582-5p在人甲状腺乳头状癌(PTC)组织中的表达及其靶向调控AKT3对PTC细胞增殖和凋亡的影响。方法选取2017年1月至2017年10月海南省肿瘤医院手术切除的PTC组织及癌旁组织(距离肿瘤边缘1~2 cm)标本各10例,采用实时定量聚合酶链反应(PCR)检测PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p表达;培养人PTC K1细胞,待细胞生长融合度达到50%~60%时分为miR-582-5p mimics组、miR-582-5p反义miRNA寡核苷酸(AMO)组、mimics对照组和AMO对照组,进行细胞转染;细胞转染后,采用实时荧光定量PCR检测4组K1细胞中miR-582-5p表达,四甲基偶氮唑盐法检测4组K1细胞活性,平板克隆形成实验检测4组K1细胞克隆能力,锥虫蓝染色检测4组K1细胞存活率,末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d UTP切口末端标记法检测4组K1细胞凋亡情况,Western blot法检测4组K1细胞中miR-582-5p靶基因AKT3蛋白表达。结果 PTC组织和癌旁组织中miR-582-5p相对表达量分别为0. 372±0. 237、1. 010±0. 083,PTC组织中miR-582-5p相对表达量显著低于癌旁组织(P <0. 05)。miR-582-5p mimics组、mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量分别为14. 143±2. 318、1. 063±0. 214、1. 041±0. 372、0. 435±0. 145; miR-582-5p mimics组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著高于mimics对照组、miR-582-5p AMO组和AMO对照组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组K1细胞中miR-582-5p相对表达量显著低于AMO对照组和mimics对照组(P <0. 05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞中miR-582-5p相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。细胞培养0 h时4组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。细胞培养12、24、36、48 h时,miR-582-5p mimics组K1细胞活性显著低于miR-582-5p AMO组、mimics对照组和AMO对照组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组K1细胞活性显著高于mimics对照组和AMO对照组(P <0. 05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞活性比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组、miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量分别为18. 47±5. 25、5. 10±4. 97、19. 53±6. 45、32. 63±7. 74; miR-582-5p mimics组K1细胞克隆数量显著少于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组K1细胞克隆数量显著多于AMO对照组和mimics对照组(P <0. 05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞克隆数量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞存活率分别为(76. 46±13. 53)%、(42. 64±10. 85)%、(77. 82±10. 35)%、(83. 63±13. 53)%; miR-582-5p mimics组K1细胞存活率显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组K1细胞存活率显著高于AMO对照组和mimics对照组(P <0. 05); mimics对照组与AMO对照组K1细胞存活率比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞凋亡率分别为(23. 35±9. 64)%、(42. 63±13. 38)%、(22. 85±9. 74)%、(10. 84±3. 64)%; miR-582-5p mimics组K1细胞凋亡率显著高于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组细胞凋亡率显著低于AMO对照组和mimics对照组(P <0. 05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞凋亡率比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。mimics对照组、miR-582-5p mimics组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量分别为1. 000±0. 005、0. 531±0. 162、1. 010±0. 071、1. 432±0. 141; miR-582-5p mimics组K1细胞中AKT3蛋白相对表达量显著低于mimics对照组、AMO对照组和miR-582-5p AMO组(P <0. 05),miR-582-5p AMO组K1细胞AKT3蛋白相对表达量显著高于AMO对照组和mimics对照组(P <0. 05),mimics对照组与AMO对照组K1细胞AKT3蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P> 0. 05)。结论 miR-582-5p在PTC组织中表达下调; miR-582-5p可通过靶向调控AKT3的表达而抑制人PTC细胞的增殖,并促进其凋亡。

MicroRNA-582-5p在HBV感染中的作用及分子机制研究

目的探究微小RNA-582-5p(microRNA-582-5p,miR-582-5p)在HBV感染中的作用及分子机制。方法通过miRNA芯片筛选出miR-582-5p作为研究对象。分别通过过表达和抑制内源性miR-582-5p表达的方法,研究其对HBV DNA、HBV RNA、HBeAg、HBsAg等HBV复制和表达相关指标的影响。在分子机制研究中,双荧光素酶报告基因检测miR-582-5p对HBV启动子和增强子的影响,生物信息学预测miR-582-5p的靶基因,分别使用实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)和Western blot检测miR-582-5p对靶基因NOTCH1 mRNA和蛋白表达的影响。最后检测HBV相关蛋白表达对miR-582-5p的影响。结果qRT-PCR结果表明miR-582-5p随着HBV复制水平升高而逐渐降低。miR-582-5p抑制HBV DNA、HBV RNA、HBeAg和HBsAg的表达。miR-582-5p能抑制HBV S2 promoter和HBV EnhancerⅠ的活性,miR-582-5p能直接靶向HBV促进因子NOTCH1,抑制其mRNA和蛋白表达。HBx蛋白抑制miR-582-5p的表达。结论miR-582-5p通过抑制HBV S2 promoter和HBV EnhancerⅠ的活性或靶向抑制HBV促进因子NOTCH1而抑制HBV复制和表达;同时,HBV的复制与表达抑制miR-582-5p的表达。

miR-211-5p在局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠模型中表达分析

目的探讨大鼠局灶性脑缺血再灌注(MCAO/R)损伤模型大鼠脑组织miR-211-5p表达情况。方法取SPF级成年大鼠40只,分为假手术组(Sham组)、MCAO/R+溶剂组(Vehicle组)、MCAO/R+miR-211-5p组(Mimic组)、MCAO/R+anti-miR-211-5p组(Antagomir组),每组10只。评价各组大鼠神经功能缺损评分,检测各组大鼠脑梗死体积及miR-211-5p、脑源性神经营养因子(BDNF)蛋白表达水平。结果Vehicle组存活率低于Sham组,Longa评分升高,miR-211-5p处理后存活率升高,Longa评分降低(P<0.05)。Mimic组脑梗死体积百分比较Vehicle组降低,Antagomir组脑梗死体积百分比高于Mimic组(P<0.05)。与Sham组和Vehicle组比较,Mimic组miR-211-5p表达量升高,Antagomir组表达量降低,Antagomir组miR-211-5p表达量低于Mimic组(P<0.05)。Mimic组BDNF表达量显著高于其他3组,Antagomir组BDNF表达量最低(P<0.05)。结论miR-211-5p表达与大鼠MCAO/R损伤相关。