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题名基于密码子优化mSaCas9蛋白的重组表达与应用
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作者
陈若雪
蒋月雯
王梦洋
许朝然
梁晶婕
陈天圣
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机构
海水养殖生物育种全国重点实验室(集美大学)/鳗鲡现代产业技术教育部工程研究中心/农业农村部东海海水健康养殖重点实验室/集美大学水产学院
华中农业大学水产学院
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出处
《广东海洋大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2024年第4期19-26,共8页
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基金
国家自然科学基金(32273127,31771648)
集美大学科研基金(ZQ2020003)。
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文摘
【目的】利用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)来源的SaCas9研究可替代商业Cas9的基因编辑蛋白,为生产适用于鱼类基因编辑的蛋白酶提供参考。【方法】以青鳉(Oryzias latipes)密码子偏好优化SaCas9(命名为mSaCas9),克隆构建重组质粒pET28a-mSaCas9,并利用大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21(DE3)原核表达mSaCas9重组蛋白,对纯化蛋白活性进行体外酶切验证;利用纯化蛋白进行显微注射,验证mSaCas9-RNP递送方式的应用性。【结果】成功构建重组质粒pET28a-mSaCas9,其重组蛋白分子质量为130 ku;在1 L培养基中纯化获得2.5 mg mSaCas9蛋白,纯度为95%;体外酶切结果显示,其终质量浓度为30 ng/μL时即可编辑tyr和oca2基因的PCR产物,表明纯化所得蛋白具备体外编辑活性;向青鳉胚胎中注射mSaCas9蛋白和黑色素合成相关基因oca2-gRNA,胚胎眼部出现色素缺失,表明mSaCas9-RNP可应用于青鳉基因组编辑。【结论】通过体外表达纯化获得了有活性且分子质量更小的Cas9蛋白,并在鱼类中证明了以递送SaCas9核糖核蛋白(SaCas9-RNP)形式,实现个体水平基因编辑的有效性。
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关键词
msaca9
基因编辑蛋白
CRISPR/Cas9
原核表达
SaCas9-RNP
显微注射
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Keywords
msaca9
gene editing protein
CRISPR/Cas9
prokaryotic expression
SaCas9-RNP
microinjection
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分类号
Q812
[生物学—生物工程]
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