基于PTEN/mTOR/STAT3通路探讨夹脊电针对脊髓损伤大鼠自噬的影响

目的观察夹脊电针对脊髓损伤(spinal and injury,SCI)大鼠第10号染色体上缺失的磷酸酶与同源张力蛋白(phosphatase and tensinhomolog,PTEN)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)/信号转导和转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)通路相关因子(p-PTEN、p-mTOR、p-STAT3)、自噬相关因子(LC3-Ⅱ、p62、Atg5)以及星形胶质细胞中星形胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(light chain 3,LC3)共定位信号的表达情况,探讨夹脊电针调控SCI细胞自噬促进神经功能恢复的可能机制,为临床运用夹脊电针治疗SCI提供新的思路和分子生物学理论依据。方法将72只雄性SD大鼠随机分为假手术(Sham)组、模型(Model)组、夹脊电针(EA)组、抑制剂+夹脊电针(bpV)组,每组按照造模后3、7和14 d治疗时间点分为3个亚组,每个亚组6只大鼠。采用Allen’s法建立SCI大鼠模型。EA组予双侧胸(T)9、T11夹脊穴,电针30 min,强度1 mA,密波(100 Hz),1次/d,分别连续治疗3、7、14 d。bpV组在电针治疗前10 min注射PTEN通路抑制剂bpV(HOpic),200μL/kg,1次/d,分别连续治疗3、7、14 d。采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分观察并比较各组大鼠后肢运动功能;HE染色观察各组大鼠脊髓组织的病理形态学变化;Nissl染色观察各组大鼠脊髓组织前角运动神经元的形态和数量;IHC检测各组大鼠脊髓组织p-PTEN、p-mTOR、p-STAT3、LC3-Ⅱ、p62、Atg5的免疫组化染色累积光密度值(imaging object definition,IOD)值;WB检测各组大鼠p-PTEN、p-mTOR、p-STAT3蛋白相对表达量;IF检测脊髓组织星形胶质细胞GFAP、LC3共定位情况。结果大鼠行为学检测结果示:与Model组比,在3、7、14 d时,EA组、bpV组BBB评分均增高(P<0.05);HE结果示:Model组脊髓组织出现大量内含片状出血以及坏死组织的空腔,神经细胞松散排列,3 d后EA组脊髓组织结构逐渐规整、空泡逐渐减少、神经元数量增加;Nissl染色结果示:与Sham组比,Model组神经元染色较浅,数量明显降低,EA组神经元染色较深,数量增多;IHC结果示:与Model组比,EA组p-PTEN、p-mTOR、p-STAT3的IOD值在3 d时明显降低(P<0.01),在7、14 d时明显增高(P<0.01);与Model组比,EA组在3 d时LC3-Ⅱ和Atg5显著升高,p62显著降低(P<0.01),在7、14 d时,LC3-Ⅱ和Atg5显著降低,p62显著增高(P<0.01);与Model组比,bpV组在3、7、14 d时LC3-Ⅱ、Atg5和p62的IOD值均降低(P<0.05);与EA组比,在3、7 d时,bpV组LC3-Ⅱ和Atg5表达均降低,p62增高(P<0.01),在14 d时,LC3-Ⅱ和Atg5降低,p62增高(P<0.05);WB结果示:与Model组相比,3 d时,EA组LC3-Ⅱ和Atg5表达显著升高,p62显著降低(P<0.01);在7、14 d时,LC3-Ⅱ和Atg5显著降低,p62显著增高(P<0.01);与Model组相比,在3、7、14 d时,bpV组LC3-Ⅱ、Atg5表达均降低,p62表达增高(P<0.05);与EA组比,在3、7 d时,bpV组LC3-Ⅱ表达较低,p62表达较高(P<0.01);在14 d时,LC3-Ⅱ明显增高(P<0.05)、Atg5明显增高,p62明显降低(P<0.01)。IF结果示:在3、7、14 d时,Model组有明显共定位信号,阳性细胞数与时间成正比。EA组的共定位阳性细胞数较Model组减少。bpV组阳性细胞数较EA组减少。结论夹脊电针能明显促进SCI大鼠后肢运动功能恢复,其机制与调控PTEN/mTOR/STAT3通路介导的自噬和星形胶质细胞生长有关。

二甲双胍抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路保护骨关节炎模型大鼠关节软骨

背景:研究表明,二甲双胍具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老与血管保护作用,可抑制骨关节炎的进展,但其具体的作用机制仍不明确。目的:探讨二甲双胍对骨关节炎模型大鼠软骨保护的作用机制。方法:取40只雄性SD大鼠,采用随机数字表法分4组(n=10):空白组不进行任何手术,假手术组暴露关节腔,模型组、二甲双胍组采用改良Hulth法建立骨关节炎模型;造模后1 d,二甲双胍组大鼠灌胃给予二甲双胍200 mg/(kg·d),模型组、空白组、假手术组灌胃给予生理盐水,连续给药4周。给药结束后,苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色观察大鼠膝关节软骨病理形态,免疫组化染色与Western blotting检测大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、ADAMTS5、Beclin1、P62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR的蛋白表达。结果与结论:①苏木精-伊红、甲苯胺蓝和番红O-固绿染色结果显示,空白组、假手术组大鼠膝关节软骨表面光滑,组织形态正常;模型组大鼠膝关节软骨表面不规则,软骨组织出现缺损,软骨细胞数量减少,软骨基质中蛋白多糖含量减少;相较于模型组,二甲双胍组大鼠膝关节软骨结构损伤有明显改善,软骨表面趋于平整,软骨细胞数量与软骨基质中蛋白多糖含量增加;②免疫组化染色与Western blotting检测结果显示,与空白组、假手术组比较,模型组大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、Beclin1蛋白表达降低(P<0.05),ADAMTS5、P62及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达升高(P<0.05);与模型组比较,二甲双胍组大鼠软骨组织中SOX9、Ⅱ型胶原、Beclin1蛋白表达升高(P<0.05),ADAMTS5、P62及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达降低(P<0.05);③结果表明,二甲双胍可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的活化提高骨关节炎模型大鼠软骨细胞自噬活性、减少软骨基质降解,进而发挥关节软骨保护作用。

异莲心碱通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬

目的:探讨异莲心碱(Iso)通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对结肠癌SW480细胞增殖、凋亡和自噬的影响。方法:用10、20和40μmol/L的Iso处理结肠癌SW480细胞,CCK-8法、流式细胞术和WB法分别检测Iso对细胞增殖活力、凋亡和自噬相关蛋白LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62表达的影响。然后,用20μmol/L的Iso和25μmol/L的PI3K激活剂740 Y-P分别处理SW480细胞,将细胞分为对照组、740 Y-P组、Iso组和Iso+740 Y-P组,流式细胞术、WB法检测Iso和740 Y-P对各组细胞凋亡及细胞中LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、PI3K、p-PI3K、mTOR和p-mTOR蛋白表达的影响。结果:10、20和40μmol/L的Iso处理后,SW480细胞增殖活力均显著下降(均P<0.05),细胞凋亡率均显著升高(均P<0.05),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著上调(均P<0.05),p26蛋白表达显著下调(P<0.05)。Iso和740 Y-P处理后,与对照组相比,740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达均显著下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05);Iso组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与740 Y-P组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达升高(P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著下降(均P<0.05);与Iso组相比,Iso+740 Y-P组细胞凋亡率、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达下降(均P<0.05),p26、p-PI3K/PI3K和p-mTOR/mTOR表达均显著升高(均P<0.05)。结论:Iso通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路抑制结肠癌SW480细胞增殖并诱导细胞凋亡和自噬。

miR-519b-3p调控IL-6/STAT3通路对宫颈癌细胞凋亡、迁移、侵袭的影响

目的探讨miR-519b-3p调控IL-6/信号转导和转录激活因子3(STAT3)通路对宫颈癌细胞(SiHa)凋亡、迁移、侵袭的影响。方法qRT-PCR检测miR-519b-3p在宫颈癌组织中的表达。SiHa细胞分为miR-NC组、miR-519b-3p组、miR-NC+RhIL-6组、miR-519b-3p+RhIL-6组。流式细胞术评估SiHa细胞凋亡率,Transwell实验检测细胞迁移和侵袭情况。Western blotting检测B细胞淋巴瘤-2基因(Bcl-2)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-cadherin、Bcl相关x蛋白(Bax)、STAT3和p-STAT3蛋白水平。结果与癌旁组织比较,宫颈癌组织miR-519b-3p表达下调(P<0.05)。SiHa细胞凋亡率、Bax和E-cadherin蛋白水平miR-519b-3p组高于miR-NC组,miR-NC+RhIL-6组低于miR-NC组,miR-519b-3p+RhIL-6组低于miR-519b-3p组(P<0.05)。SiHa细胞迁移数、侵袭数、Bcl-2、N-cadherin、p-STAT3蛋白水平miR-519b-3p组低于miR-NC组,miR-NC+RhIL-6组高于miR-NC组,miR-519b-3p+RhIL-6组高于miR-519b-3p组(P<0.05)。结论miR-519b-3p通过抑制IL-6/STAT3通路来抑制宫颈癌细胞迁移和侵袭,并增加细胞凋亡。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

调补心肾方通过活化PI3K/Akt/mTOR通路促进阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性相关蛋白的合成

目的探讨调补心肾方(党参、制首乌、枸杞子、黄芪等)对阿尔茨海默病5xFAD转基因小鼠突触可塑性的影响及机制。方法取5月龄雄性野生型(WT)小鼠和5xFAD转基因小鼠各18只,分别随机分为对照组(0.9%NaCl)、调补心肾方组(颗粒剂,4.18 g·kg^(-1))、安理申组(盐酸多奈哌齐,0.625 mg·kg^(-1)),每组6只。按照上述分组灌胃给药,每日1次,共60 d。采用透射电镜观察小鼠海马组织超微结构;Western Blot法检测小鼠皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1、NMDAR1、p-CaMKⅡa、CaMKⅡa、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR蛋白表达水平。结果与WT对照组比较,5xFAD对照组小鼠海马CA1区突触的超微结构不规则,线粒体萎缩、减少,线粒体嵴断裂、消失,突触膜弯曲不规则,突触囊泡减少,突触后致密物(PDS)变薄甚至断裂;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达均明显下调(P<0.05)。与5xFAD对照组相比较,5xFAD调补心肾方组小鼠海马CA1区突触的超微结构有明显变化,线粒体数量增加,突触囊泡增多,突触膜完整,突触后致密物有增厚现象;皮层组织中Synaptophsin、PSD-95、p-NMDAR1/NMDAR1、p-CaMKⅡa/CaMKⅡa、PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白表达明显上调(P<0.05)。结论调补心肾方可能通过活化PI3K/Akt/mTOR通路,促进突触可塑性相关蛋白合成,进而改善AD的认知功能障碍。

miR-495-3p靶向BUB1调控STAT3信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨miR-495-3p靶向苯并咪唑出芽抑制解除同源物蛋白1(BUB1)调控信号转导及转录激活因子3(STAT3)信号通路对食管癌细胞生物学行为的影响。方法 使用cDNA芯片技术筛选出食管癌组织和正常组织差异表达基因,并用生物信息学方法进行分析。运用TargetScan数据库对miRNA的靶基因进行预测,并用双荧光素酶报告基因检测技术进行验证。将KYSE150细胞分为空白对照组、NC mimics组和miR-495-3p mimics组。通过细胞计数试剂盒8(CCK-8)检测细胞增殖活力。用流式细胞术测定细胞周期和凋亡。通过定量逆转录聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定BUB1 mRNA的表达水平。通过蛋白质印迹法(Western blot)测量BUB1、STAT3、磷酸化(p)-STAT3、细胞周期蛋白B1(CCNB1)、细胞周期蛋白依赖性激酶1(CDK1)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、半胱氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)和半胱氨酸蛋白水解酶9(Caspase-9)蛋白水平。用划痕和Transwell小室实验测定细胞的迁移和侵袭能力。结果 差异表达基因参与生物学过程、信号通路和网络构建主要与细胞周期相关,BUB1是关键的核心(Hub)基因,miR-495-3p靶向调控BUB1。体外实验表明,过表达miR-495-3p能显着抑制食管癌细胞的生长、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡和G2/M期阻滞。过表达miR-495-3p处理后,食管癌细胞中Caspase-3、Caspase-9表达量升高(P<0.01),而Bcl-2、BUB1、CCNB1、CDK1、p-STAT3表达量降低(P<0.01)。STAT3信号通路也被发现在此过程中发挥着重要作用。结论 miR-495-3p可能通过下调BUB1介导STAT3信号通路影响食管癌细胞的生物学行为。

基于STAT3信号通路研究柠檬苦素对胃癌模型小鼠免疫因子表达的影响

目的 分析柠檬苦素对胃癌小鼠模型免疫因子表达的影响并探索其作用机制。方法 选取50只SPF级小鼠,随机分为5组各10只,构建MFC胃癌荷瘤模型,建模成功后随机分为模型组、阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组并给予对应药物灌胃,1次/d,连续14 d。计算脾指数、胸腺指数及抑瘤率;流式细胞术检测CD4^(+)、CD8^(+) T细胞及其比值;酶联免疫吸附试验检测血清免疫因子白细胞介素(IL)-2、IL-10、干扰素(IFN)-γ的表达水平;免疫组化法检测胃癌组织磷酸化信号转导与转录激活因子(p-STAT3)、基质金属蛋白酶(MMP)-9阳性表达率;Western印迹法检测胃癌细胞STAT3磷酸化水平。结果 与模型组相比,阳性对照组脾指数、胸腺指数显著降低(P<0.05),柠檬苦素低、中、高剂量组脾指数、胸腺指数显著升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、柠檬苦素低、中、高剂量组抑瘤率均显著增加(P<0.05)。柠檬苦素低、中、高剂量组CD4^(+)、CD8^(+) T淋巴细胞百分数和CD4^(+)/CD8^(+)比值较模型组显著上升(P<0.05)。与模型组相比,阳性对照组IL-2、IL-10水平显著下降,IFN-γ显著上升(P<0.05);而柠檬苦素低、中、高剂量组IL-2、IFN-γ水平显著增加,IL-10显著降低(P<0.05)。与模型组相比,阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组p-STAT3、MMP-9的阳性表达率均显著下降(P<0.05)。与模型组相比,阳性对照组及柠檬苦素低、中、高剂量组第705位点酪氨酸的磷酸化STAT3蛋白(pTyr^(705)-STAT3)水平均显著降低(P<0.05)。结论 柠檬苦素能抑制胃癌小鼠模型肿瘤组织的发展,这与其提高小鼠免疫水平与抑制STAT3通路激活密切相关。

茯苓酸调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进结直肠癌细胞凋亡的机制研究

目的 研究茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢及细胞凋亡的调控作用。方法 通过细胞活性测定(Cell Counting Kit-8,CCK8)、克隆形成等实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞增殖与细胞活性的影响;采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞凋亡实验检测茯苓酸对结直肠癌细胞凋亡的影响;使用细胞氧气消耗率和细胞外酸化率测定仪器及细胞葡萄糖代谢水平测定试剂盒检测茯苓酸对结直肠癌细胞葡萄糖代谢的影响;通过蛋白免疫印迹(Western blotting, WB)实验验证凋亡、糖酵解、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)/丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶(AKT Serine/Threonine Kinase 1,AKT)/雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin, mTOR)通路相关蛋白表达情况。结果 茯苓酸能够有效抑制结直肠癌细胞增殖与细胞活性,并能够通过抑制其糖酵解水平促进其细胞凋亡,同时显著抑制PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平。结论 茯苓酸可通过调控PI3K/AKT/mTOR通路介导葡萄糖代谢促进CRC细胞凋亡,可作为未来结直肠癌代谢靶向治疗的潜在药物。

基于Hepcidin和JAK2/STAT3信号通路探讨通痹颗粒 对胶原诱导性关节炎大鼠的影响

目的研究通痹颗粒对胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠铁调素(hepcidin,Hepc)、Janus激酶(janus kinase,JAK)2/信号转导子和转录激活子(signal transduction and activator of transcription,STAT)3信号通路的影响。方法选取36只雌性SD大鼠随机分成空白组、模型组、阳性对照组和通痹颗粒低、中、高剂量组,每组6只。空白组不予处理,其余组用牛Ⅱ型胶原建立CIA模型。造模完成后,空白组、模型组予生理盐水灌胃,其余各组分别以巴瑞替尼片和低、中、高剂量通痹颗粒灌胃。每天1次,连续4周。HE染色行滑膜组织病理学观察;酶联免疫吸附法测定血清Hepc、白细胞介素6(interleukin 6,IL-6)水平;逆转录-聚合酶链反应法测定滑膜中JAK2、STAT3、细胞信号因子传导抑制体(suppressor of cytokine signaling,SOCS)1、SOCS3的mRNA相对表达量;Western blot法检测滑膜中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、SOCS1、SOCS3的蛋白表达量。结果模型组见滑膜上皮结构缺损,滑膜重度增生,排列紊乱,并有大量炎症细胞浸润和多个血管翳形成;各给药组滑膜炎症均有所减轻,阳性对照组优于通痹颗粒高剂量组,通痹颗粒中、高剂量组优于低剂量组。与模型组相比,各给药组关节炎指数评分、血清Hepc和IL-6水平均显著降低(P<0.01);与阳性对照组相比,通痹颗粒中、低剂量组关节炎指数评分、血清Hepc和IL-6水平均升高(P<0.05)。与模型组比较,阳性对照组和通痹颗粒低、中、高剂量组JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量均降低(P<0.05),而通路抑制因子SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表达均升高(P<0.05);与阳性对照组比较,通痹颗粒各剂量组JAK2、STAT3 mRNA和蛋白以及p-JAK2、p-STAT3的蛋白表达量均升高(P<0.05),而SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白的表达均降低(P<0.05)。结论通痹颗粒能够改善CIA大鼠滑膜炎症,其机制可能与抑制JAK2/STAT3信号通路而减少Hepc的表达有关。

静态磁场通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型

目的:通过体外实验探讨静态磁场(SMF)对皮肤成纤维细胞增殖活性和迁移表型的调控作用与潜在机制。方法:将人皮肤成纤维细胞(HSFs)分为5组,包括对照组、SMF组、SMF+阿魏酸组、SMF+芦可替尼组、SMF+Stattic组。对照组为正常培养的HSFs;SMF组的HSFs细胞暴露于1mT的SMF中。其余三组分别将FGFR1、JAK2、STAT3的抑制剂(3μmoL/L阿魏酸、3nmoL/L芦可替尼、20μmoL/L的Stattic)与HSFs一起预培养,并暴露于1mT的SMF中,所有组均处理24h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)分析细胞的增殖活性。用ELISA试剂盒法检测人类B细胞淋巴瘤2相关X蛋白(BAX)的水平。用Western blot检测凋亡标志蛋白cleaved-caspase3及FGFR1、JAK2、STAT3、磷酸化的(p)-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3的表达以及细胞迁移相关表型高迁移率组蛋白1(HMGB1)、波形蛋白(vimentin)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、MMP-2的表达。结果:与对照组比,SMF组的细胞增殖活性增加,BAX的水平减少,cleaved-caspase3的蛋白表达水平下调,p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著上调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+阿魏酸组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,而p-FGFR1、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+芦可替尼组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,JAK2、p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。与SMF组比,SMF+Stattic组的细胞增殖活性降低,BAX的水平增加,cleaved-caspase3的蛋白表达水平上调,STAT3、p-STAT3、HMGB1、vimentin、VEGFA、MMP-9、MMP-2的表达水平均显著下调(均P<0.05)。结论:SMF通过激活FGFR1/JAK2/STAT3信号通路促进皮肤成纤维细胞的增殖活性和迁移表型。

木兰花碱调控CD44s/STAT3通路对肺癌细胞迁移、侵袭及干性特征的影响实验研究

目的:探讨木兰花碱(Mag)对肺癌细胞迁移、侵袭、干性特征的影响及其作用机制。方法:使用不同浓度的Mag(0、10、20、40、80、160μmol/L)作用于肺癌细胞A549,检测细胞存活率,根据半抑制浓度(IC 50)值选择10、20、40μmol/L Mag进行后续实验。将肺癌细胞A549随机分为A549组、Mag-L组(10μmol/L Mag培养基培养)、Mag-M组(20μmol/L Mag培养基培养)、Mag-H组(40μmol/L Mag培养基培养)和Mag-H+信号转导及转录激活因子3(STAT3)激活剂Colivelin组(40μmol/L Mag+10μmol/L Colivelin培养基培养)。采用平板克隆形成实验检测各组细胞克隆形成数量。采用流式细胞术检测各组细胞凋亡率。采用Transwell实验检测各组细胞迁移及侵袭能力。采用肿瘤细胞成球实验检测细胞干性。采用Western blot检测各组细胞CD44s/STAT3通路及细胞干性相关蛋白表达。结果:与A549组比较,Mag-L组、Mag-M组、Mag-H组细胞克隆形成数量、迁移及侵袭细胞数、干细胞成球数和细胞中CD44s、STAT3、CD133、八聚体结合转录因子4(OCT4)、SRY-box转录因子2(SOX2)表达水平逐渐降低,而细胞凋亡率逐渐升高(均P<0.05)。在高浓度Mag的基础上加入STAT3激活剂Colivelin逆转了以上指标的变化趋势。结论:Mag能够抑制肺癌细胞迁移、侵袭及干性特征,其机制可能与下调CD44s/STAT3通路有关。

纤维粘连蛋白靶向JAK/STAT3信号通路调控粘连性肠梗阻的机制

目的:探究纤维粘连蛋白(FN)靶向JAK/STAT3信号通路调控粘连性肠梗阻的作用机制。方法:选取2019年1月—2020年12月就诊行肠切除手术的粘连性肠梗阻患者65例(观察组),同期行腹股沟疝手术患者65例(对照组),取患者肠组织及术前血液样本,采用qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学实验检测肠组织样本中FN、STAT3、p-STAT3基因及蛋白表达,采用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测血清样本中FN表达。体外培养人肠上皮细胞系HIEC-6,采用慢病毒转染抑制细胞FN表达,采用CCK8、Transwell迁移实验观察FN对细胞增殖及分化的影响,同时采用qRT-PCR、Western Blot实验检测FN对细胞STAT3、p-STAT3表达的影响。结果:与对照组比较,观察组肠组织中FN mRNA及蛋白表达明显较高(P<0.05),STAT3、p-STAT3 mRNA及蛋白表达则明显较低(P<0.05),且观察组血清中分泌型FN含量也明显较高(P<0.05)。体外实验显示,与NC siRNA组HIEC-6细胞比较,LV-FN siRNA组HIEC-6细胞在48、72、96、120 h的增殖率均明显较低(P<0.05),细胞迁移能力也明显较低(P<0.05),其FN mRNA及蛋白表达明显较低(P<0.05),STAT3、p-STAT3 mRNA及蛋白则明显较高(P<0.05)。结论:纤维粘连蛋白在粘连性肠梗阻患者肠组织及血清中呈明显高表达,可通过JAK/STAT3信号通路的异常激活影响细胞的增殖和迁移,引起病变肠段发病。

颠倒散对玫瑰痤疮小鼠炎症反应及IL-6/STAT3/NF-κB通路的影响

目的探讨颠倒散(DDS)对玫瑰痤疮小鼠炎症反应、白细胞介素-6(IL-6)/信号转导子及转录激活因子3(STAT3)/核转录因子κB(NF-κB)通路的影响。方法皮内注射LL37建立玫瑰痤疮小鼠模型,随机分为模型组、DDS低剂量(DDS-L,0.5 g/mL DDS)、中剂量(DDS-M,1 g/mL DDS)、高剂量(DDS-H,2 g/mL DDS)组及DDS-H+重组IL-6蛋白(rIL-6)组(2 g/mL DDS+0.1 mg/kg rIL-6),并以皮内注射相同部位生理盐水的小鼠为对照组,每天1次,干预7 d;干预结束后,对小鼠注射部位皮肤红斑进行评分及面积测定;收集皮损组织,ELISA检测IL-6、干扰素-γ(IFN-γ)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α),HE染色观察皮损组织病理学变化,甲苯胺蓝检测肥大细胞浸润,免疫组化检测CD4 T阳性细胞数,Western blot检测IL-6/STAT3/NF-κB通路相关蛋白表达。结果与对照组比较,模型组小鼠注射部位皮肤组织损伤严重,皮肤红斑评分及红斑面积增加,皮损组织中IL-6、IFN-γ及TNF-α水平增高,肥大细胞浸润数、CD4 T阳性细胞数增加,IL-6、STAT3及NF-κB蛋白表达显著增加(P均<0.05);与模型组比较,DDS-L组、DDS-M组、DDS-H组病理损伤不同程度减轻,皮肤红斑评分及红斑面积减小,皮损组织中IL-6、IFN-γ及TNF-α水平降低,肥大细胞浸润数、CD4 T阳性细胞数减少,IL-6、STAT3及NF-κB蛋白表达显著降低(P均<0.05),不同剂量DDS组间比较,差异有统计学意义(P均<0.05);rIL-6逆转了对DDS-H对玫瑰痤疮小鼠的保护作用。结论DDS减少玫瑰痤疮小鼠的炎症反应,可能与抑制IL-6/STAT3/NF-κB通路有关。

藏红花素通过抑制JAK2/STAT3信号通路减轻脑缺血再灌注大鼠海马神经元损伤

目的研究藏红花素(CRO)对脑缺血再灌注(CI/R)大鼠海马神经元损伤的影响并探索其潜在机制。方法将144只雄性SD大鼠按照随机数字表法分为假手术(Sham)组,模型(CI/R)组,CRO低、中、高剂量(CRO-L、CRO-M、CRO-H)组和尼莫地平(NMP)组6组,每组24只。采用线栓法制备CI/R大鼠模型,各组分别于造模前7 d开始1次/d腹腔注射(ip)给药(CRO-L、CRO-M、CRO-H组分别ip给药10、20、40 mg/kg,NMP组ip给药1 mg/kg,Sham组和CI/R组ip给予生理盐水5 mL/kg)。再灌注24 h后,通过Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力,TTC染色检测脑梗死率,HE染色法行海马CA1区和CA3区神经元病理学检查,TUNEL染色法行海马CA1区和CA3区神经元凋亡检查,ELISA法检测海马组织白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-8、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量,Western blot法检测海马组织Janus激酶2/信号转导与转录激活子3(JAK2/STAT3)信号通路相关蛋白相对表达量。结果与Sham组比较,CI/R组学习记忆能力明显降低,脑梗死率明显升高(P<0.05);海马CA1区和CA3区神经元呈现数量减少、间隙增大、空泡样变、核膜核仁边界模糊、炎性细胞浸润等病理改变,凋亡率明显升高(P<0.05);海马组织IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显升高(P<0.05);p-JAK2、p-STAT3、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶-3(cleaved Caspase-3)相对表达量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bax/Bcl-2表达比值均明显升高,Bcl-2相对表达量明显降低(P<0.05)。与CI/R组比较,CRO-M组、CRO-H组和NMP组大鼠学习记忆能力显著改善、脑梗死率明显降低(P<0.05);海马CA1区和CA3区神经元病理学改变明显改善、凋亡率明显降低(P<0.05);海马组织IL-1β、IL-8、TNF-α含量明显降低(P<0.05);p-JAK2、p-STAT3、HMGB1、Bax、Cleaved Caspase-3相对表达量和p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、Bax/Bcl-2表达比值均明显降低(P<0.05)。CRO上述作用呈现一定的剂量依赖性,且CRO-H组对CI/R大鼠学习记忆能力、海马CA1区和CA3区神经元病理学改变和凋亡率、炎症因子含量、JAK2/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响显著优于NMP组(P<0.05)。结论CRO可能通过抑制JAK2/STAT3信号通路活化,减轻炎症和神经元凋亡,从而对CI/R大鼠海马神经元损伤起到保护作用。

彝药痹Ⅱ号介导KLF2调控PI3K/Akt/mTOR通路对类风湿性关节炎小鼠模型表达及生物学行为特性影响的机制研究

目的:探讨彝药痹Ⅱ号介导KLF2调控PI3K/Akt/mTOR通路对类风湿性关节炎小鼠模型表达及生物学行为特性影响的机制。方法:80只昆明种小鼠分为对照组、模型组、彝药痹Ⅱ号组低、高剂量组;除对照组外,其余各组通过左后足趾皮内注射弗氏完全佐剂建立小鼠RA模型;彝药痹Ⅱ号组低、高剂量组于造模成功第1天开始给予相应剂量药物灌胃,持续给予3个月,对照组和模型组给予等体积生理盐水。试验结束后测定小鼠PEL、关节炎症积分、足趾容积;RT-PCR法、蛋白印迹法、免疫组化法测定小鼠踝关节软骨KLF2、PI3K、Akt、mTOR水平。结果:模型组小鼠PEL低于对照组,关节炎症积分、足趾容积高于对照组(P<0.05);彝药痹Ⅱ号低、高剂量组小鼠PEL高于对照组,关节炎症积分、足趾容积低于对照组(P<0.05);且随着彝药痹Ⅱ号剂量的逐渐升高,各剂量组小鼠PEL逐渐升高,关节炎症积分、足趾容积逐渐降低(P<0.05)。模型组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平高于对照组(P<0.05);与模型组比较,彝药痹Ⅱ号低、高剂量组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);且随着彝药痹Ⅱ号剂量的逐渐升高,各剂量组小鼠踝关节KLF2、PI3K、Akt、mTOR mRNA和蛋白表达水平逐渐降低(P<0.05)。结论:彝药痹Ⅱ号对小鼠类风湿性关节炎具有明显治疗作用,能明显抑制小鼠踝关节软骨滑膜炎症反应;其机制与彝药痹Ⅱ号抑制类风湿性关节炎小鼠踝关节软骨炎症KLF2-PI3K-Akt-mTOR通路的激活有关。

丹参酮ⅡA通过抑制JAK2/STAT3通路减轻慢性萎缩性胃炎大鼠胃黏膜损伤的机制研究

[目的]研究丹参酮ⅡA(TanⅡA)对慢性萎缩性胃炎(CAG)大鼠胃黏膜的影响,并基于Janus激酶2(JAK2)/信号转导与转录激活子3(STAT3)通路探讨其机制。[方法]将80只Wistar大鼠随机分为5组(n=16):正常(Normal)组、模型(Model)组、TanⅡA(5 mg/kg)组、TanⅡA(5 mg/kg)+AG490(JAK2抑制剂,5 mg/kg)组和Tan IIA(5 mg/kg)+C-A1(JAK2激动剂,50 mg/kg)组。除Normal组外,其他4组均采用N-甲基-N'-硝基-N-亚硝基胍溶液(MNNG,0.04 g/mL)自由饮联合雷尼替丁灌胃、饥饱失常饮食的综合法构建CAG大鼠模型。各组分别每日1次连续给药治疗12周后,中性红清除法检测胃黏膜血流量,酶联免疫吸附法(ELISA)法检测血清胃泌素(GAS)、血浆胃动素(MTL)及胃黏膜炎症因子水平,苏木精-伊红(HE)染色法观察胃黏膜组织病理学改变并行萎缩评分,TUNEL染色法观察胃黏膜细胞凋亡状况并计算凋亡指数,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法、蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测胃黏膜JAK2/STAT3通路相关mRNA和蛋白表达。[结果]与Model组相比,TanⅡA组大鼠胃黏膜血流量、血清GAS水平、血浆MTL水平均明显升高(P<0.05);胃黏膜中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6等炎症因子水平明显降低(P<0.05);胃黏膜病理学改变明显改善,萎缩评分明显降低(P<0.05);胃黏膜凋亡细胞数量明显减少,凋亡指数明显降低(P<0.05);胃黏膜JAK2、STAT3 mRNA表达量明显降低(P<0.05);B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)蛋白表达量明显升高,Bcl-2相关X蛋白(Bax)、激活型半胱氨酸蛋白酶3(C-Cas-3)、C-Cas-9蛋白表达量及p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3、胞核核因子-κB(NF-κB)p65/胞浆NF-κB p65表达比值明显降低(P<0.05)。AG490能够明显增强TanⅡA对CAG大鼠各检测指标的调控作用,C-A1则能够明显逆转TanⅡA对CAG大鼠各检测指标的调控作用(P<0.05)。[结论] TanⅡA可能通过抑制JAK2/STAT3通路活化及NF-κB核转位,减轻炎症反应和细胞凋亡,从而减轻CAG大鼠胃黏膜结构和功能损伤。

基于JAK2/STAT3信号通路探讨黄芪-山茱萸对高糖诱导足细胞损伤的保护作用

目的:探究黄芪-山茱萸对高糖诱导肾足细胞损伤的保护作用及机制。方法:CCK8法检测黄芪-山茱萸(0、175、350、700、1400、2800 mg/L)对足细胞(MPC-5)活性的影响。30 mmol/L葡萄糖诱导MPC-5细胞损伤,350、700、1400 mg/L黄芪-山茱萸进行干预;ELISA测定MPC-5细胞IL-6、IL-1β水平,流式细胞术测定细胞凋亡,免疫荧光染色测定MPC-5肾病蛋白(nephrin)、足细胞素(podocin)表达,qRT-PCR测定MPC-5细胞nephrin、podocin、结蛋白(desmin)、Wilm瘤基因1(WT-1)基因表达,Western blot测定细胞Janus激酶2/信号转导和转录激活因子3(JAK2/STAT3)信号通路磷酸化表达。结果:2800 mg/L黄芪-山茱萸可显著抑制MPC-5细胞活性(P<0.01)。MPC-5细胞经高糖诱导后,IL-6、IL-1β水平升高,凋亡增加,nephrin、podocin、WT-1表达降低,desmin表达升高,JAK2/STAT3信号通路磷酸化表达增加(P<0.01)。350、700、1400 mg/L黄芪-山茱萸可抑制高糖诱导MPC-5细胞IL-6、IL-1β水平升高和凋亡,增强nephrin、podocin、WT-1表达,降低desmin表达,抑制JAK2/STAT3信号通路磷酸化表达(P<0.05)。结论:黄芪-山茱萸可减轻高糖诱导足细胞炎症和凋亡损伤,其机制与抑制JAK2/STAT3通路磷酸化有关。

布比卡因通过PI3K/AKT/mTOR通路对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响

目的 探讨布比卡因对膀胱癌细胞凋亡和铁死亡的影响及其机制。方法 常规培养人膀胱癌细胞(T24和5637)和人尿路上皮细胞(SV-HUC-1),MTT实验检测布比卡因细胞毒性,筛选合适处理浓度,将T24和5637细胞分为对照组、0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因组、布比卡因+铁死亡激动剂(Erastin)组、布比卡因+铁死亡抑制剂(Fer-1)组细胞和布比卡因+PI3K激动剂(740Y-P)组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率,相应试剂盒检测Fe^(2+)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平,Western blot检测Bcl-2、Bax、细胞色素C、xCT、GPX4和磷脂酰肌醇3/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)相关蛋白表达。结果 0.25、0.5、1、2、4、8、16 mmol/L布比卡因均可明显抑制T24和5637细胞的活性(P<0.001),选择仅对癌细胞有毒性的0.25、0.5和1 mmol/L布比卡因进行后续研究。与对照组比较,随着布比卡因浓度增加,T24和5637细胞凋亡率、Fe^(2+)、ROS和MDA水平逐渐升高,GSH水平逐渐降低,差异有统计学意义(P<0.001);与1 mmol/L布比卡因组比较,布比卡因+Erastin组Fe^(2+)水平升高,而布比卡因+Fer-1组降低,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,与对照组比较,布比卡因组细胞色素C蛋白表达增高,Bax/Bcl-2、xCT、GPX4表达,以及PI3K p85α/PI3K、p-AKT(Thr308)/AKT、p-AKT(Ser473)/AKT和p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值降低,差异有统计学意义(P<0.001)。验证实验结果显示,与对照组比较,布比卡因+740Y-P组细胞活力和GSH水平升高,Fe^(2+)水平和细胞色素C蛋白表达降低(P<0.001)。结论 布比卡因可通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路激活诱导膀胱癌细胞凋亡和铁死亡。

橄榄苦苷调节IL-6/STAT3信号通路对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的 初步探讨橄榄苦苷(Ole)调节白细胞介素-6(IL-6)/信号转导与转录激活子3(STAT3)信号通路对肺癌细胞恶性生物学行为的影响。方法 MTT法检测细胞增殖抑制率,筛选Ole最佳干预浓度;将A549细胞分为对照组、Ole低、中、高剂量组、rIL-6组(Ole高剂量+IL-6/STAT3通路激活剂)。A549细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡依次用EdU染色、Transwell、流式细胞术检测;增殖细胞核抗原(PCNA)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、切割型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-3(Cleaved Caspase-3)及IL-6/STAT3信号通路蛋白表达用Western Blot法检测;构建肺癌移植瘤模型,测定移植瘤的体积和质量,免疫组化检测移植瘤中Ki-67、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白表达,TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡。结果 与对照组比较,Ole低、中、高剂量组EdU阳性细胞率、迁移与侵袭细胞数、PCNA、MMP-2、IL-6、p-STAT3/STAT3表达显著降低,细胞凋亡率、Cleaved Caspase-3表达显著升高(P<0.05);IL-6/STAT3通路激活剂rIL-6减弱了Ole对A549恶性生物学行为抑制作用(P<0.05);体内实验表明,Ole显著降低移植瘤质量、体积及Ki-67、MMP-9、IL-6、p-STAT3/STAT3蛋白表达,升高肿瘤细胞凋亡率(P<0.05)。结论 Ole在体内体外可能通过抑制IL-6/STAT3信号通路,进而抑制A549细胞的恶性生物学行为。