基于脂噬介导的mTOR/TFEB信号通路探讨当归红芪超滤物干预糖尿病肾病作用机制

目的以当归红芪超滤物干预糖尿病肾病模型大鼠,探讨其对糖尿病肾病脂噬的效应机制。方法50只SPF级雄性Wistar大鼠随机选取7只为空白组,其余43只采用一次性大剂量腹腔注射链脲佐菌素联合高脂高糖饲料喂养制备糖尿病肾病模型。将成模大鼠随机分为模型组、厄贝沙坦组(17.9 mg/kg)和中药低、中、高剂量组(1.5、3、6g/kg),分别灌胃相应溶液,连续12周。检测大鼠随机血糖、体质量及24h尿蛋白含量,生化检测糖化血清蛋白(GSP)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)含量,HE染色观察肾组织形态变化,Masson染色观察肾组织纤维化情况,透射电镜观察肾组织超微结构,RT-qPCR检测肾组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白1轻链3(LC3B)mRNA表达,Westernblot检测肾组织mTOR、转录因子EB(TFEB)、p-TFEB、LC3B蛋白表达。结果与空白组比较,模型组大鼠随机血糖显著升高(P<0.01),体质量显著减少(P<0.01),24h尿蛋白含量显著升高(P<0.01),GSP、SCr、BUN、TG、TC、LDL-C、FFA含量显著升高(P<0.01),HDL-C含量显著降低(P<0.01);肾小管上皮细胞空泡变性、胞质空泡化、有大量炎性细胞浸润,胶原纤维增多且分布杂乱,脂滴数量增加,自噬体数量减少;肾组织mTORmRNA表达显著升高(P<0.01),LC3BmRNA表达显著降低(P<0.01),mTOR、p-TFEB蛋白表达显著升高(P<0.01),TFEB、LC3BⅡ蛋白表达显著降低(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠给药12周随机血糖、24h尿蛋白含量降低,体质量增加,GSP、SCr、BUN、TG、TC、LDL-C、FFA含量降低,HDL-C含量升高;肾组织炎性细胞浸润、纤维化、脂滴沉积有不同程度缓解,肾组织mTORmRNA表达降低,LC3BmRNA表达升高,mTOR、p-TFEB蛋白表达降低,TFEB、LC3BⅡ蛋白表达升高,其中厄贝沙坦组和中药高剂量组差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。结论当归红芪超滤物能改善糖尿病肾病模型大鼠糖脂代谢紊乱、拮抗肾脏异位脂质沉积、促进脂噬、延缓糖尿病肾病进程,其机制可能与mTOR/TFEB信号通路有关。

基于Akt/mTOR信号通路探讨补肾活血方对去卵巢大鼠软骨细胞自噬的影响

目的:研究补肾活血方是否可以通过调控Akt/mTOR信号通路促进去卵巢大鼠软骨细胞自噬反应来保护关节软骨。方法:选取30只SPF级12周龄雌性SD大鼠,体重(247.0±7.0)g,先随机选择6只为空白对照组,剩余大鼠采用卵巢切除术结合右膝关节腔注射碘乙酸钠(monosodium iodoacetate,MIA)建立绝经后膝骨关节炎模型,随机分为模型组、BSHXR-L组、BSHXR-M组、BSHXR-H组,每组6只。运用肉眼观察评分、番红O-固绿染色、免疫组化等方法明确补肾活血方对大鼠关节软骨损伤的保护作用,Western-blot检测自噬相关蛋白的表达,qPCR检测Akt、mTOR及下游自噬基因的相对表达。结果:造模后BSHXR(L、M、H)各组均可减轻软骨组织形态学损伤,免疫组化示Collagen-Ⅱ、Aggrecan表达逐渐升高,基质金属蛋白酶-13(matrix metallopriteinase-13,MMP-13)表达逐渐降低,其中BSHXR-M组和BSHXR-H组与模型组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Western-blot结果示BSHXR(L、M、H)各组自噬通路蛋白p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR受到抑制,下游蛋白Beclin-1、LC3Ⅱ表达逐渐升高,而p62逐渐降低,呈剂量效应。qPCR结果示BSHXR(L、M、H)各组均可促进Beclin-1、LC3ⅡmRNA的相对表达,抑制p62、Akt、mTOR mRNA的相对表达,与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)。结论:补肾活血方可以通过抑制Akt/mTOR信号通路增强软骨细胞自噬反应,进而发挥保护软骨的作用。

甲基莲心碱通过调节AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻慢性皮肤溃疡大鼠的炎症反应

目的:探讨甲基莲心碱(Nef)调节AMP活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)/NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)信号通路对慢性皮肤溃疡(CSU)大鼠炎症反应的影响。方法:将90只大鼠随机分为空白对照组(NC组)、CSU组、Nef组、AMPK抑制剂(Compound C)组、Nef+Compound C组,每组18只大鼠。除NC组外的其他各组大鼠通过剪开创口注射氢化可的松以及喷洒金黄色葡萄球菌构建CSU大鼠模型。造模完成后,Nef组和Compound C组分别将20%Nef、10μmol·L^(-1) Compound C与50 mL的20%高渗盐水凝胶混合敷在伤口处,Nef+Compound C组将20%Nef和10μmol·L^(-1) Compound C一起添加到20%高渗盐水凝胶中敷在伤口处,持续治疗2周,NC组、CSU组用等量盐水凝胶处理伤口。观察大鼠皮肤创面愈合情况;ELISA法检测血清白细胞介素(IL)-1β、IL-8、TNF-α水平;水解法检测创面肉芽组织中羟脯氨酸(HyP)水平;HE染色检测肉芽组织病理学变化;Western blotting检测CCL4、CCL2、CXCL12以及AMPK/mTOR/NLRP3信号通路蛋白表达水平。结果:CSU组大鼠可看到新生肉芽组织,并且有大量炎症细胞浸润现象,CSU组较NC组IL-1β、IL-8、TNF-α含量显著升高(P<0.05);与CSU组相比,Nef组创面愈合率、HyP含量、p-AMPK/AMPK蛋白水平显著增加(P<0.05),IL-1β、IL-8、TNF-α含量、CCL2、CXCL12、CCL4、mTOR、NLRP3蛋白水平显著下降(P<0.05),而Compound C组趋势相反(P<0.05);Compound C消除了Nef对CSU大鼠炎症反应的减轻作用。结论:Nef可能通过调控AMPK/mTOR/NLRP3信号通路减轻CSU大鼠炎症反应。

栀子苷调节PI3K/AKT/mTOR信号通路在动脉粥样硬化形成过程中对Th17/Treg功能的影响

目的:观察栀子苷对载脂蛋白E缺乏(ApoE^(-/-))小鼠Th17/调节性T(Treg)细胞失衡的影响及其作用机制。方法:将50只纯合子ApoE^(-/-)雌性小鼠随机分为对照组、模型组和栀子苷低剂量组、栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组。对照组小鼠喂养普通饲料,模型组和栀子苷组小鼠喂养高脂饲料。从第8周开始,栀子苷各剂量组每日灌胃栀子苷(25、50、100 mg/kg),连续8周。试验结束时,采用油红O染色评估主动脉及其根部动脉粥样硬化(AS)病变面积比。采用定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)分析主动脉组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-17A和IL-10 mRNA表达;采用流式细胞仪分析脾脏中Th17和Treg细胞百分比;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测主动脉组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达。结果:油红O染色病变显示,栀子苷中剂量组、栀子苷高剂量组病变百分比低于模型组(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平升高(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉TNF-α、IL-6和IL-17A mRNA表达水平降低(P<0.05)。与对照组比较,模型组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平降低(P<0.05);栀子苷各剂量组主动脉抗炎细胞因子IL-10 mRNA表达水平升高(P<0.05)。与对照组比较,模型组小鼠脾脏中Th17细胞百分比升高,Treg细胞百分比降低(P<0.05)。栀子苷处理恢复了AS小鼠Th17和Treg细胞的平衡。栀子苷抑制PI3K的表达及AKT和mTOR的磷酸化,MHY1485(mTOR活化剂)减弱了栀子苷对T细胞分化的影响。结论:栀子苷抗AS作用机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号引起的Treg细胞增多和Th17细胞减少有关。

低蛋白饲料补充必需氨基酸对异育银鲫生长、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因的影响

实验以初重为(12.71±0.11)g的异育银鲫“中科5号”(Carassius gibelio var.CAS V)为研究对象,基于异育银鲫必需氨基酸需求量,探究在低蛋白饲料中补充必需氨基酸对异育银鲫生长、消化、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因表达的影响。实验设计3组等能饲料:CON组(35%粗蛋白)、LP组(28%粗蛋白)和LP+EAA组(28%粗蛋白+晶体氨基酸),养殖周期为50d。实验结果显示:低蛋白饲料中补充必需氨基酸显著提高异育银鲫生长性能(P<0.05),并与CON组无显著差异(P>0.05);LP+EAA组的肝脏谷草转氨酶活性显著高于LP组(P<0.05),而谷丙转氨酶活性各组间无显著差异(P>0.05);补充必需氨基酸对肠道中胰蛋白酶和淀粉酶活性有显著影响(P<0.05),而对糜蛋白酶和脂肪酶无显著影响(P>0.05)。肠道中cat2、asct2和b0at1三种氨基酸转运蛋白显著上调(P<0.05),LP组的b0,+at的相对表达量显著下调(P<0.05),而pept1的表达各组间无显著差异(P>0.05);肝脏中LP组tor相对表达量显著降低(P<0.05),LP+EAA组的s6k1表达水平显著上调(P<0.05),而4ebp2和eif4e的相对表达量在各组间无显著差异(P>0.05);背肌中LP+EAA组的tor表达水平显著上调(P<0.05),LP组的eif4e表达水平显著下调(P<0.05),而s6k1和4ebp2的相对表达量在各组间无显著差异(P>0.05)。综上所述,向异育银鲫“中科5号”幼鱼饲料中补充必需氨基酸至需求量可以将饲料蛋白水平由35%降至28%,而不会对生长、氨基酸转运和mTOR信号通路相关基因表达等产生负面影响。

低蛋白饲料添加亮氨酸、精氨酸对大菱鲆幼鱼生长、消化、免疫及mTOR信号通路的影响

为探究亮氨酸和精氨酸作为信号分子参与调控mTOR信号通路对大菱鲆(Scophthalmus maximus)生长的作用,本研究以大菱鲆幼鱼(初始体质量(13.50±0.19)g)为实验对象,设置50%蛋白水平饲料作为阳性对照组,45%蛋白水平饲料作为阴性对照组,设置两个实验组,分别为在阴性对照组中添加1%亮氨酸的实验组和添加1%精氨酸的实验组,饲养周期为56 d,测量大菱鲆的生长性能和饲料利用水平。研究表明,添加亮氨酸、精氨酸均能一定程度提高因饲料蛋白水平不足导致的大菱鲆的特定生长率、蛋白质效率和增重率下降。添加1%亮氨酸和1%精氨酸均能在摄食后有效增强大菱鲆肌肉与肝脏mTOR信号通路中的雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体蛋白S6和真核起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)的磷酸化。添加1%精氨酸还能够提高大菱鲆肠道淀粉酶和脂肪酶活性,显著提高血清过氧化氢酶和溶菌酶水平并增加血清总抗氧化能力。研究结果表明,在低蛋白饲料中添加1%亮氨酸、1%精氨酸能够激活大菱鲆mTOR信号通路,有效提高其生长性能和蛋白质效率;此外,添加1%精氨酸还能够提高大菱鲆的消化酶活性、增强非特异性免疫反应。

Sesn2通过激活mTOR信号通路调节LPS诱导的巨噬细胞M1极化和炎症反应

目的:探讨sestrin 2(Sesn2)在巨噬细胞中的功能及其通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路对巨噬细胞极化和炎症的影响。方法:用小干扰RNA构建Sesn2沉默(si-Sesn2)的RAW264.7小鼠巨噬细胞胞株,通过脂多糖(LPS)处理RAW264.7细胞建立体外炎症模型。RT-qPCR评估白细胞介素1β(IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、CD86和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的mRNA水平;ELISA检测培养液中IL-1β、IL-6和TNF-α水平;流式细胞术确定CD86标记的M1型巨噬细胞百分比;Western blot分析mTOR、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)和真核翻译启动因子4E结合蛋白1(4EBP1)的蛋白表达水平。结果:在LPS诱导的体外炎症模型中,Sesn2在RAW264.7细胞中的表达上调,IL-1β、IL-6、TNF-α以及M1型巨噬细胞标志物CD86和iNOS的表达显著增加,伴随mTOR、p70S6K和4EBP1蛋白表达水平的升高。而si-Sesn2进一步促进了上述效应,但这些变化可通过雷帕霉素预处理减轻。结论:Sesn2可通过mTOR/p70S6K/4EBP1信号通路调控巨噬细胞M1型极化,并影响促炎因子的表达。

索拉非尼基于Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬在肝细胞癌中产生耐药机制研究进展

肝细胞癌(HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,它的形成是一个复杂的过程,其具体形成机制尚不明确,由于大多数HCC患者被诊断出来时已是晚期,通常已丧失良好的手术时机。而靶向药物的出现给当前HCC患者带来了新的希望,同时还可作为术后治疗措施,在HCC中发挥着巨大的作用。索拉非尼是第一个被用于治疗HCC的靶向药物,它可抑制肝肿瘤组织血管生成和细胞增殖,可诱导肝肿瘤细胞凋亡,进而提高部分肝癌患者的生存率。但据目前研究显示,有50%~60%HCC经治患者对该药物出现了敏感性下降。主要是由于索拉非尼使用后会抑制体内相关信号通路,从而致使耐药的发生,故进一步探索索拉非尼耐药机制,使其逆转索拉非尼耐药对于改善肝癌治疗的预后具有极其重要的临床价值。近些年来,许多学者致力研究索拉非尼通过Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路介导细胞自噬与耐药性的产生有着密切联系。并探讨其耐药分子机制,使该领域获得了巨大的发展。因此,本篇文章主要从Hippo/YAP及PI3K/Akt/mTOR信号通路展开,探讨其与细胞自噬之间的关系以及介导的耐药机制,为索拉非尼治疗肝癌产生耐药性提供可靠的科学理论依据。

TMSB10促进胃癌细胞增殖及糖酵解:基于激活AMPK/mTOR信号通路

目的探究胸腺素β10(thymosinβ10,TMSB10)在胃癌中的表达及促进胃癌进展的分子机制。方法收集蚌埠医学院第二附属医院70例胃癌患者病理切片,免疫组化检测TMSB10在胃腺癌中的表达,并分析其预后影响。为研究作用机制,通过转染技术、CCK8实验、EDU实验、Transwell小室实验,划痕实验,糖酵解实验,蛋白印迹实验,观察TMSB10对胃癌细胞的增殖和糖酵解的影响及机制研究。结果临床样本免疫组化显示,TMSB10在胃癌中高表达。同时,TMSB10的表达水平与肿瘤大小(P<0.05)、TNM分期(P<0.01)和远处转移具有相关性。在机制研究中,通过体外实验CCK-8、EDU实验、Transwel实验及糖酵解检测实验发现过表达TMSB10后促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及糖酵解表型,反之亦然。Western blot实验结果显示过表达TMSB10可能通过上调AMPK/mTOR信号通路调节胃癌的发生。结论TMSB10通过AMPK/mTOR信号通路促进胃癌细胞增殖、侵袭、迁移及糖酵解过程。

DCLK1激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进A549细胞的恶性行为

目的探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)对A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响,并探究可能涉及的相关分子机制。方法慢病毒感染法建立稳定表达DCLK1分子的A549细胞系,反转录-聚合酶链技术和蛋白质印记法进行鉴定。CCK-8与平板克隆实验检测过表达DCLK1后细胞增殖能力变化。Transwell实验观察过表达DCLK1对细胞迁移与侵袭能力的影响。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析DCLK1对肺腺癌细胞的调控富集通路,蛋白质印记法进行验证。结果DCLK1在A549细胞中过表达可增加细胞的增殖、迁移与侵袭等能力,而抑制FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路可削弱DCLK1对A549细胞的恶性调控。结论DCLK1通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进A549细胞的恶性生物学行为。

巴伐奇宁调节PI3K/AKT/mTOR信号通路对结直肠癌细胞恶性进展的影响

目的:探讨巴伐奇宁(BVC)对结直肠癌细胞恶性进展的影响,分析其与调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路的相关性。方法:将SW480细胞分为对照组(未处理)、低剂量巴伐奇宁组(L-BVC组,10μmol/L)、中剂量巴伐奇宁组(M-BVC组,20μmol/L)、高剂量巴伐奇宁组(H-BVC组,40μmol/L)、Ly294002组(25μmol/L PI3K抑制剂Ly294002)、H-BVC+740Y-P组(40μmol/L BVC和10μmol/L PI3K激活剂740Y-P)。CCK-8法检测SW480细胞增殖情况;流式细胞术检测SW480细胞凋亡情况;划痕实验检测SW480细胞迁移能力;Transwell法检测SW480细胞侵袭能力;Western blot检测细胞中PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达情况。结果:与对照组比较,L-BVC组、M-BVC组、H-BVC组、Ly294002组OD值、划痕愈合率、侵袭细胞数、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与H-BVC组比较,H-BVC+740Y-P组OD值、划痕愈合率、侵袭细胞数、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值均显著升高(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论:BVC可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,进而抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,促进结直肠癌细胞凋亡。

电针预处理通过调控AKT/mTOR信号通路减轻缺血再灌注大鼠心肌损伤

目的观察电针预处理对心肌缺血再灌注损伤大鼠的影响并探讨其作用机制。方法30只SD大鼠随机抽取6只为假手术组(只穿线不结扎),剩余大鼠采用冠脉结扎法建立心肌缺血再灌注损失(MIRI)大鼠模型,并在造模前1周分别进行电针内关预处理、雷帕霉素预处理和雷帕霉素+电针内关预处理。造模结束后用HE染色法检测心肌细胞病理形态学变化;ELISA法检测血清中CK-MB和IL-6含量;Western-blot法检测Beclin1、Caspase3及磷酸化的AKT、mTOR蛋白表达。结果与模型组比较,电针组心肌纤维断裂减少、细胞间质出血减少,其损伤程度与假手术组较为接近;与雷帕霉素组比较,雷帕霉素+电针组心肌纤维断裂减少、细胞水肿程度减轻。与假手术组比较,模型组大鼠CK-MB、IL-6、Beclin1和Caspase3表达明显升高,p-AKT、p-mTOR表达明显下调(P<0.01);与模型组比较,电针组大鼠CK-MB、IL-6、Beclin1和Caspase3表达明显下调,p-AKT、p-mTOR表达明显升高(P<0.01);与电针组比较,雷帕霉素+电针组大鼠IL-6、CK-MB、Beclin1和Caspase3表达明显升高(P<0.05或P<0.01),p-AKT、p-mTOR表达明显下调(P<0.01)。结论电针内关预处理减轻大鼠MIRI可能与激活AKT/mTOR信号通路相关。

基于PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨化瘀通络灸促血管性痴呆大鼠髓鞘再生的作用机制

目的观察化瘀通络灸对血管性痴呆(vascular dementia,VD)大鼠胼胝体磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路的影响,探讨化瘀通络灸促VD大鼠髓鞘再生的作用机制。方法经Morris水迷宫筛选后,随机选取12只大鼠纳入假手术组,剩余大鼠复制VD模型成功后,随机分为模型组、艾灸组、艾灸+LY294002组,每组12只。艾灸组予以化瘀通络灸干预,艾灸+LY294002组在化瘀通络灸干预的基础上予以PI3K抑制剂LY294002腹腔注射,采用Longa评分法评价各组大鼠神经功能损伤程度,Morris水迷宫实验检测各组大鼠学习记忆能力,Western blot法检测各组大鼠PI3K/AKT/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,神经髓鞘固蓝染色法观察各组大鼠胼胝体髓鞘的形态,透射电子显微镜观察各组大鼠髓鞘超微结构。结果与假手术组比较,模型组和艾灸+LY294002组大鼠的Longa评分显著升高(P<0.05),逃避潜伏期显著延长(P<0.05),PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平显著降低(P<0.05),胼胝体内髓鞘纹理不清,排列混乱,边缘呈空泡或空网状改变,髓鞘线圈样结构离散,部分膨出和崩解,有髓神经轴突数量显著减少(P<0.05);与模型组和艾灸+LY294002组比较,艾灸组大鼠Longa评分显著下降(P<0.05),逃避潜伏期显著缩短(P<0.05),PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达水平显著提高(P<0.05),胼胝体内髓鞘结构有所恢复,排列整齐,边缘结构较为致密,有髓神经轴突数量显著增加(P<0.05)。结论化瘀通络灸可能通过激活PI3K/AKT/mTOR通路,修复VD大鼠损伤髓鞘并促进其重塑,恢复脑白质功能。

mTOR和ERK/MAPK信号通路调控自噬在孤独症发病中的作用

孤独症是一种以重复刻板样行为和社交缺陷为主要特征的神经发育障碍性疾病,发病率高的特点使其逐渐成为研究的热点。中国与西方国家孤独症的发病率相似,约为1%,位于儿童精神疾病的前列^([1])。目前认为孤独症由环境和遗传因素共同决定,病因复杂,具体机制尚不明确。随着研究的深入,自噬在孤独症发病机制中的作用受到广泛关注。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨骨化三醇对闭合性腰椎压缩性骨折的干预效果

目的基于磷脂酰肌醇3⁃激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,探讨骨化三醇对闭合性腰椎压缩性骨折的干预效果。方法选取我院2020年1月至2022年9月收治的150例闭合性腰椎压缩性骨折患者,按1∶1∶1比例分层随机分为空白组、对照组、观察组,每组各50人。3组均采取卧床静养、使用复位垫、硬板床、腰背肌训练、口服维D钙咀嚼片(规格750 mg×60 s),2片/次,1次/日治疗,空白组口服安慰剂胶囊,1粒/次,1次/日;对照组口服阿法骨化醇(规格0.25μg×20 s),2粒/次,1次/日;观察组口服骨化三醇胶囊(规格0.25μg×10 s),1粒/次,1次/日;各组均持续12周。评价治疗前后Os⁃westy功能障碍指数(ODI)和疼痛视觉模拟评分(VAS);检测PI3K/Akt/mTOR通路的蛋白表达;检测骨代谢指标:血清钙、血清磷、骨密度、骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)、骨密度调节蛋白(OPG),RANK配体(RANKL)。结果治疗前3组VAS、ODI、骨密度、骨代谢指标、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。治疗12周后,与空白组对比,对照组和观察组VAS评分、ODI指数、血清钙、RANKL指数及PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平显著降低,血清磷、ALP、骨密度、骨钙素、OPG指数升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,观察组ODI指数、VAS评分下降,骨密度、血清磷、ALP、骨钙素、OPG升高,血清钙、RANKL、PI3K、Akt、mTOR蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论骨化三醇可能通过对PI3K/Akt/mTOR通路双向调节作用:一方面激活PI3K/Akt/mTOR信号通路,促进骨折愈合;另一方面降低PI3K/Akt蛋白表达,抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路,改善骨折导致炎症反应。

WIN55212-2通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路抑制糖酵解并减轻脓毒症小鼠急性肺损伤

目的:探究大麻素受体激动剂WIN55212-2(WIN)对脓毒症小鼠急性肺损伤(ALI)的影响,并探讨其通过糖酵解发挥作用的可能机制。方法:采用腹腔注射脂多糖(LPS)创建小鼠脓毒症ALI模型。将雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:对照(control)组、LPS组(腹腔注射10 mg/kg LPS)、LPS+WIN组(注射LPS前30 min腹腔注射1 mg/kg WIN)和LPS+WIN+MHY1485[哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)活化剂]组(LPS造模前1 d腹腔注射10 mg/kg MHY1485,并在造模前30 min腹腔注射1 mg/kg WIN和10 mg/kg MHY1485),每组6只。造模24 h后取材,计算肺指数;HE染色观察肺组织病理变化;ELISA检测肺组织炎症因子白细胞介素1β(IL-1β)和IL-10表达水平,以及血清乳酸和乳酸脱氢酶A(LDHA)水平;Western blot检测mTOR/缺氧诱导因子1α(HIF-1α)/6-磷酸果糖-2-激酶/果糖-2,6-双磷酸酶3(PFKFB3)信号通路相关蛋白水平。结果:相比于control组,LPS组小鼠肺指数增加,HE染色显示肺组织受损,肺组织中IL-10水平降低(P<0.05),IL-1β水平升高(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平升高(P<0.05),磷酸化mTOR(p-mTOR)、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平升高(P<0.05)。相较于LPS组,LPS+WIN组肺指数降低(P<0.05),HE染色显示肺组织受损减轻,肺组织IL-1β水平降低(P<0.05),IL-10水平升高(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平降低(P<0.05),p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平降低(P<0.05)。相较于LPS+WIN组,LPS+WIN+MHY1485组肺指数增加,HE染色显示肺组织受损,肺组织IL-1β水平升高(P<0.05),IL-10水平降低(P<0.05),血清乳酸和LDHA水平升高(P<0.05),p-mTOR、HIF-1α和PFKFB3蛋白水平升高(P<0.05)。结论:WIN55212-2可以减轻脓毒症小鼠ALI,其机制可能是通过调控mTOR/HIF-1α/PFKFB3信号通路,抑制糖酵解,减轻炎症反应。

基于AMPK/mTOR/ERRα信号通路探讨慈菇消脂方影响非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝细胞自噬作用机制

目的基于AMPK/mTOR/ERRα信号通路探讨慈菇消脂方对非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠肝细胞自噬的调控机制。方法小鼠随机分为空白组、模型组、慈菇消脂方组和抑制剂组,每组10只。采用蛋氨酸胆碱缺乏饲料喂养构建NASH小鼠模型,造模成功后给药组予相应药物干预,连续4周。HE染色观察小鼠肝组织形态并进行非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)活动度评分,电镜观察肝细胞超微结构,免疫组化检测肝组织Beclin1、LC3、p62蛋白表达,Western blot检测肝组织p-AMPK、p-mTOR、雌激素相关受体α(ERRα)蛋白表达。结果与空白组比较,模型组小鼠肝组织出现明显脂肪变性并可见大量炎性细胞浸润,肝细胞可见大量形态较规则的单层膜脂质结构,NAFLD活动度评分升高(P<0.01),肝组织Beclin1、LC3、p-AMPK蛋白表达降低(P<0.01),p62、p-mTOR、ERRα蛋白表达升高(P<0.01);与模型组比较,各给药组小鼠肝组织脂肪变性减少,炎性细胞浸润改善,可见少量自噬体,NAFLD活动度评分降低,肝组织Beclin1、LC3、p-AMPK蛋白表达升高(P<0.01,P<0.05),p62、p-mTOR、ERRα蛋白表达降低(P<0.01)。结论慈菇消脂方可能通过调控AMPK/mTOR/ERRα信号通路相关蛋白表达介导自噬,延缓NASH进展。

蟛蜞菊内酯通过PI3K/Akt/mTOR信号通路对人脐静脉内皮细胞氧化损伤的影响

目的研究蟛蜞菊内酯(WEL)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)炎症损伤的保护作用及其分子机制。方法建立过氧化氢(H_(2)O_(2))诱导HUVECs氧化应激损伤模型,给予200μmol·L^(-1) H_(2)O_(2)处理24 h。实验分组:正常对照组、二甲亚砜(DMSO)组、H_(2)O_(2)组、WEL组(20μmol·L^(-1))。通过噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞存活率,流式细胞术检测细胞内活性氧(ROS)水平,荧光显微镜观察各分组细胞p62蛋白表达情况。Western blotting测定细胞中mTOR、p-mTOR、PI3K、p-PI3K、SOD1等蛋白表达水平。结果与H_(2)O_(2)组比较,WEL组HUVECs细胞存活率升高(P<0.01),细胞内ROS减少,SOD1表达增强,自噬体膜上p62蛋白聚集增多;与H_(2)O_(2)损伤组相比,WEL能明显增加损伤后HUVECs的p-mTOR蛋白表达水平(P<0.01)。结论WEL可通过抑制H_(2)O_(2)诱导的HUVECs炎症损伤,从而抑制HUVECs自噬,这一作用与WEL促进PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化,抑制自噬,从而抵抗HUVECs细胞氧化应激损伤有关。

基于Akt/mTOR信号通路探讨洋地黄毒苷调控甲状腺滤泡上皮细胞自噬与凋亡的机制

目的探究洋地黄毒苷对脂多糖刺激下的人甲状腺滤泡上皮细胞系Nthy-roi3-1凋亡与自噬的影响及其作用机制。方法①将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷低剂量组、脂多糖+洋地黄毒苷中剂量组及脂多糖+洋地黄毒苷高剂量组,各组进行对应处理后,CCK-8法检测各组细胞活力,免疫荧光染色观察各组细胞自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达情况,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Bcl-2同源结构域蛋白抗体(Beclin 1)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、蛋白激酶B(Akt)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、p70S6K蛋白表达情况。②将Nthy-roi3-1细胞分为对照组、脂多糖组、脂多糖+洋地黄毒苷组、脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组,各组进行对应处理后,流式细胞术检测各组细胞凋亡率,Western blot法检测各组细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR及p70S6K蛋白表达情况。结果①与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷各组的细胞活力均明显升高(P均<0.05);LC3荧光染色强度随洋地黄毒苷剂量增加逐渐增强,细胞凋亡率均明显降低(P均<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。②与脂多糖组比较,脂多糖+洋地黄毒苷组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)。与脂多糖+洋地黄毒苷组比较,脂多糖+洋地黄毒苷+自噬抑制剂组细胞凋亡率明显升高(P<0.05),细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和Beclin1蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),细胞中p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、p70S6K蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05)。结论洋地黄毒苷能够促进脂多糖刺激下Nthy-roi3-1细胞自噬,抑制细胞凋亡,该作用可能与其抑制Akt/mTOR信号通路的激活有关。

基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨乌苏酸对结肠癌细胞的影响

目的:探讨乌苏酸(UA)对结肠癌细胞的影响及其作用机制。方法:设立空白对照组及不同浓度UA给药组,采用CCK-8法测定各组细胞的增殖活力,通过细胞划痕实验测定各组细胞的迁移能力及通过Western blot法测定UA对PI3K/Akt/mTOR信号通路的影响。结果:CCK-8实验表明UA能明显降低SW480及LOVO结肠癌细胞生存率,且随着药物浓度的升高,细胞的生存率显著降低(P<0.05)。细胞划痕实验表明,与对照组相比,低浓度的UA处理的细胞愈合率降低不明显(P>0.05),而高浓度的UA处理的细胞的愈合率明显降低(P<0.05)。Western blot实验结果显示,UA处理过的细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达量明显下降(P<0.05)。结论:UA可通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的表达,从而抑制结肠癌细胞增殖、迁移,具有明确的抗肿瘤性。