不同时间的热处理对大鼠肌肉Akt/mTOR信号途径的影响

热处理会诱导骨骼肌中肌肉蛋白的合成及肌肉肥大,同时刺激细胞信号途径.另外,有报道表明38℃以上的热处理以温度依赖性方式激活细包内信号途径.然而,骨骼肌细胞中热刺激对信号途径的持续性影响方面鲜有报道.因此,分析了热处理对大鼠骨骼肌中信号途径的作用.利用Western blot技术检测热处理后不同时间点(30,60和90min)的腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明,Akt及mTOR的磷酸化水平没有变化,磷酸化的p70S6K及4E-BP1水平有所上调,而热激蛋白HSP72的水平有所下调.

PI3K/AKT/mTOR信号转导途径在嗜铬细胞瘤发生和发展中的作用及其联合靶向治疗

PI3K/AKT/m TOR信号途径在嗜铬细胞瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。单独抑制其中某个靶点却会导致对于上游靶点的反馈激活以及平行信号途径的激活,导致肿瘤对针对这一信号途径抑制剂的抵抗。该文就PI3K/akt/m TOR信号通路在嗜铬细胞瘤发生和发展中的作用以及针对这一信号通路的靶向治疗,特别是多靶点多信号途径的联合靶向治疗的最新研究进展进行综述。

shRNA干扰NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Akt/mTOR信号通路的影响

本研究旨在探讨RNA干扰沉默NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Akt/m TOR信号通路的影响。针对NOTCH1基因设计短发夹RNA并将其连入p GPU6/GFP/Neo质粒中,构建NOTCH1 shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞;应用RT-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,M TT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、procaspase-3、procaspase-9及Akt/m TOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-m TOR、p-P70S6K的表达。结果表明:NOTCH1 shRNA转染Jeko-1细胞后,NOTCH1基因的mRNA和蛋白表达均明显下调,有统计学差异(P<0.05);转染组增殖率明显低于NegshRNA组和空白组(P<0.05),NOTCH1 shRNA转染48 h后,凋亡率为(34.58±3.46)%,而Neg-shRNA组和空白组分别为(2.44±1.35)%、(1.72±0.64)%,有统计学差异(P<0.05);凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-3、procaspase-9的表达下调,而BAX表达上调;干扰NOTCH1基因后Akt总蛋白未见明显变化,而p-Akt、p-m TOR、pP70S6K的表达下降。结论:干扰沉默NOTCH1基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过去磷酸化抑制Akt/m TOR信号通路可能是其机制之一。

紫檀芪调节PI3K/Akt/mTOR信号通路保护心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制研究

目的构建心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠模型,观察紫檀芪对其的作用,并从磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路研究其作用机制。方法按随机数字法将清洁级SD大鼠72只分为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组(MI/RI组)、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组,每组12只。假手术组和MI/RI组给予10 mL/kg生理盐水灌胃治疗,紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组分别给予紫檀芪10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃,阿司匹林组则给予30 mg/kg阿司匹林灌胃,每日1次,连续灌胃2周。经冠状动脉左前降支结扎30 min,后再灌注2 h构建MI/RI模型,彩超检测心脏功能后处死,收集心脏检测心肌梗死面积、心肌组织病理学及心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,收集血液检测心功能肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果与假手术组比较,MI/RI组左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)明显升高(P<0.05),左室短轴缩短率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)明显降低(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均能降低LVESD(P<0.05),升高LVEF和LVFS(P<0.05),但LVEDD无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,MI/RI组心肌梗死面积明显升高(P<0.05),紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均可明显降低梗死面积(P<0.05);与假手术组比较,MI/RI组心肌组织病理学可见有明显损伤,而紫檀芪低、中和高剂量组相较于假手术组损伤程度明显减轻;与假手术组比较,MI/RI组大鼠血清CK-MB、AST、LDH、IL-1β、IL-6和TNF-α均明显升高(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组均明显降低(P<0.05);与假手术组比较,MI/RI组PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平明显降低(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均可有效提高PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平(P<0.05)。结论紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌具有明显保护作用,其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路实现的。

不同温度热处理对大鼠骨骼肌Akt/mTOR信号通路的影响

热处理会诱导应急蛋白,从而促进细胞蛋白质合成并进一步导致肌肉肥大.但热处理对细胞内蛋白质合成中主要信号通路Akt/mTOR信号途径的影响鲜有报道.本研究分析了热处理对大鼠骨骼肌中Akt/mTOR信号途径的作用.利用Western blot技术检测了不同温度(37℃、38℃、39℃、40℃)的热处理对大鼠腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明39℃、40℃的热处理能够激活Akt及下游p70S6K的活性而对于热激蛋白HSP72的表达水平没有影响.

吴茱萸碱作用mTOR信号通路引起胃癌SGC-7901细胞凋亡的研究

吴茱萸碱(evodiamine)是中药吴茱萸最主要的具有抗肿瘤活性的生物碱之一,研究初步探讨吴茱萸碱作用哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用机制,为其抗肿瘤机制的探索及胃癌临床治疗奠定基础。采用MTT法观察吴茱萸碱单独作用对SGC-7901细胞及对人外周血单个核细胞(PBMCs)的细胞毒效应。Real-time PCR,Western blot分别检验吴茱萸碱单独或联合胱天蛋白酶抑制剂(z-VAD-fmk)作用后,m TOR,p70S6K和4EBP1基因表达以及m TOR和p-m TOR蛋白表达。结果表明,吴茱萸碱抑制SGC-7901细胞增殖存在时间剂量依赖性,且对人PBMCs无细胞毒作用。吴茱萸碱及联合z-VAD-fmk分别作用后,细胞变圆,漂浮于培养基中;与对照组比较,2种处理方法均能抑制m TOR,p70S6K和4EBP1基因表达,存在显著性差异,且与吴茱萸碱单独作用比较,联合z-VAD-fmk作用对基因表达抑制率加强;Western blot结果显示吴茱萸碱可以抑制m TOR和p-m TOR蛋白的表达无论是否有z-VAD-fmk的参与,且z-VAD-fmk阻断胱天蛋白酶作用后,抑制率增强。综上说明吴茱萸碱可能通过m TOR信号通路促进胃癌SGC-7901细胞凋亡。

姜黄素对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的观察姜黄素对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,并探讨其可能的影响机制。方法体外培养大鼠肾系膜细胞,同步后用血清刺激,并用不同浓度的姜黄素、姜黄素联合mTOR特异阻断剂雷帕霉素、姜黄素和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)特异抑制剂LY294002进行干预处理。采用RT-PCR检测CTGF和纤维连接蛋白(Fn)mRNA表达;Western blot检测CTGF蛋白和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达。结果①血清刺激系膜细胞6 h,姜黄素浓度依赖性抑制CTGF和Fn mRNA的表达;姜黄素联合雷帕霉素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制作用较单用同浓度姜黄素明显;LY294002预处理后,姜黄素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制作用较未预处理组减弱。②25μmol/L姜黄素作用细胞301、20 min,p-Akt蛋白表达较同时间点血清对照组明显减弱;且LY294002预处理后姜黄素对p-Akt表达的抑制作用较未预处理组亦明显减弱。③血清刺激系膜细胞24 h,姜黄素对CTGF蛋白的表达亦起抑制作用;姜黄素联合雷帕霉素对CTGF蛋白表达抑制更明显;LY294002预处理后,姜黄素对CTGF蛋白表达的抑制效果较未预处理组减弱。结论姜黄素可抑制血清刺激的肾小球系膜细胞CTGF的表达,其机制可能与PI3K/Akt信号途径和mTOR信号途径有关。

去酰基化ghrelin抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖

目的探讨去酰基化ghrelin (DAG)对上皮性卵巢癌细胞增殖的作用及其相关分子机制。方法培养上皮性卵巢癌细胞SKOV3,以DAG处理,并予以激动剂干预哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)和经典Wnt信号途径,采用CCK-8法测定细胞增殖。结果DAG呈剂量依赖性抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。DAG抑制m TOR信号途径,抑制经典Wnt信号转录活性以及下游靶基因的mRNA水平,mTOR和Wnt信号激活可在一定程度上翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用。结论 DAG通过抑制m TOR和经典Wnt信号通路发挥其抑制卵巢癌细胞增殖的作用,为卵巢癌防治提供新思路。

下调Notch1基因促进人肝癌细胞系HepG2自噬

目的探讨Notch1基因对人肝癌细胞系HepG2的增殖、凋亡、自噬及Akt/mTOR信号通路的影响。方法选择于新乡医学院第三附属医院行肝癌手术治疗患者的肝癌组织32例,荧光定量PCR检测Notch1 mRNA的表达。构建Notch1 siRNA真核表达载体,经脂质体转染入HepG2细胞中,应用RT-qPCR及Western blot鉴定Notch1的干扰效果,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、cleared-caspase-3,自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达。结果Notch1基因在原发性肝细胞癌组织中的相对表达量(1.865±0.791)显著高于癌旁组织(0.709±0.414)(P<0.001)。Notch1 siRNA转染HepG2细胞后,Notch1 siRNA组中Notch1 mRNA及蛋白的表达均显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。Notch1 siRNA组24、48、72及96 h的细胞增殖率显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。转染48 h后,Notch1 shRNA组细胞的凋亡率及Bax水平显著高于NC siRNA和对照组,而Bcl-2、cleaved caspase-3的表达显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。Notch1 siRNA组细胞中自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5的表达量显著高于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。而Notch1 siRNA组的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表达量显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。结论下调Notch1基因的表达可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,提高细胞的自噬水平,其机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路有关。

桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨桔梗皂甙D(platycodin,PD)与伊马替尼(imatinib,IM)联合用药抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562的作用及机制研究。方法体外培养CML细胞株K562,CCK-8测定PD和IM单药及联合用药对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测Annexin V/PI标记的细胞凋亡率,Western blot方法检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PARP、cleaved PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白表达。结果联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡率较单独用药组效果明显,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.01或0.05)。结论 PD与IM联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和PI3K/AKT/m TOR信号通路方面明显优于单独用药。

shRNA干扰mTOR基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖抑制及其作用机制研究

目的 探讨RNA干扰沉默mTOR基因后对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法 设计针对mTOR基因短发夹RNA,将其连入pGPU6/GFP/Neo质粒中,构建mTOR shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞,采用实时定量PCR及Western blot方法鉴定其干扰效果;用MTT法绘制细胞生长曲线,经流式细胞术检测细胞凋亡的变化,用Western blot方法检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、procaspase-3 、procaspase-9及mTOR下游底物激酶P70S6K、p-P70S6K的表达.结果 mTOR shRNA转染Jeko-1细胞后,mTOR基因的mRNA及蛋白表达均明显下降（P＜0.05）;转染组增殖率明显低于Neg-shRNA组和空白对照组（P＜0.05）,mTOR shRNA转染48 h后,凋亡率为（36.62±3.24）％,而Neg-shRNA组和空白对照组分别为（2.58±1.04）％、（1.24±0.30）％,差异有统计学意义（P＜0.05）;凋亡相关蛋白 Bcl-2、procaspase-3、procaspase-9的表达下降,而Bax表达上升,mTOR下游底物激酶P70S6K未见明显变化,而其活性形式p-P70S6K的表达下降.结论 干扰沉默mTOR基因后可通过抑制mTOR信号通路的活性,抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,激活凋亡相关蛋白诱导细胞凋亡.

桔梗皂苷D联合伊马替尼对白血病耐药细胞K562/R的抑制增殖和作用机制研究

桔梗皂苷D（platycodin D,PD）对多种恶性肿瘤有显著抑制作用,对白血病细胞有明显的增殖抑制和诱导凋亡的作用,但其是否有效提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性及其发挥功能的分子机制仍未阐明。为了研究PD与伊马替尼（imatinib,IM）联合用药对慢性粒细胞白血病耐药细胞株K562/R的作用及机制。细胞增殖实验检测桔梗皂苷D对伊马替尼增殖抑制功能的影响,采用CCK8测定PD和IM单药及联合用药对K562/R增殖的抑制作用;流式细胞术检测Annexin V-FITC/PI双标记细胞凋亡率的变化,Western blot法检测cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,PARP,cleaved PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白表达。结果显示桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562/R细胞的增殖抑制作用和细胞凋亡率比单独用药组效果明显。Western blot法检测结果显示与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3,cleaved caspase-9,cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP,Bcr/abl,p-AKT,p-mTOR蛋白的表达。结果表明桔梗皂苷D可以提高耐药细胞对伊马替尼的敏感性,联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和激活PI3K/AKT/mTOR信号通路方面明显优于单独用药。