右美托咪定通过Akt/mTOR自噬通路介导NLRP3炎症小体失活而减轻脓毒症大鼠肠损伤

目的:探讨右美托咪定(DEX)是否通过蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路介导核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体失活从而减轻脓毒症大鼠肠损伤。方法:随机数字法对50只大鼠分组:假手术组、模型组、DEX组(0、3和6 h腹腔注射10μg/kg DEX)、DEX+NVP-BEZ235组(在DEX组基础上腹腔注射30 mg/kg NVP-BEZ235)及DEX+3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(在DEX组基础上腹腔注射15 mg/kg 3-MA),每组10只。除假手术组外,其余各组盲肠结扎穿孔术(CLP)建立脓毒症大鼠模型,建模后给药。HE染色观察肠道组织形态,对结肠标本进行结肠大体形态损伤指数(CMDI)评分;ELISA检测血清中白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平;免疫组化检测肠道组织中自噬相关蛋白beclin-1和LC3-II蛋白水平;Western blot检测肠道组织中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、NLRP3、含caspase募集结构域的凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、caspase-1及其前体pro-caspase-1的蛋白水平。结果:模型组大鼠肠道组织完整性被破坏,细胞脱落和炎症浸润现象明显;DEX组大鼠肠道组织完整,仅出现部分细胞脱落和炎症浸润现象;DEX+NVP-BEZ235组和DEX+3-MA组大鼠肠道完整性被破坏,细胞脱落和炎症浸润明显。与假手术组相比,模型组大鼠CMDI评分,血清中IL-1β和TNF-α水平,肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率,p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR、NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平升高(P<0.05);与模型组相比,DEX组大鼠CMDI评分,血清中IL-1β和TNF-α水平,肠道组织中NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平降低(P<0.05),肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率及p-Akt/Akt和pmTOR/mTOR蛋白水平升高(P<0.05);与DEX组相比,DEX+NVP-BEZ235组和DEX+3-MA组血清中IL-1β和TNF-α水平及肠道组织中NLRP3、ASC和caspase-1/pro-caspase-1蛋白水平升高(P<0.05),肠道组织中beclin-1和LC3-II蛋白阳性率及p-Akt/Akt和p-mTOR/mTOR蛋白水平降低(P<0.05)。结论:DEX能够通过激活Akt/mTOR通路促进自噬而介导NLRP3炎症小体失活,从而减轻脓毒症大鼠肠损伤。

鬼针草总黄酮调控PI3K/Akt/mTOR自噬通路对高血压大鼠心肌纤维化的影响

目的探讨鬼针草总黄酮(TFB)调控磷脂肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)自噬通路对自发性高血压(SHR)大鼠心肌纤维化(MF)的影响。方法将30只SHR大鼠随机分为5组:SHR组、SHR+坎地沙坦组、SHR+TFB组、SHR+IGF-1(PI3K/Akt/mTOR通路激活剂)组、SHR+TFB+IGF-1组,每组6只。另取6只年龄匹配的雄性WKY大鼠作为WKY大鼠对照组。WKY大鼠对照组和SHR组大鼠予剂量匹配的生理盐水灌胃,SHR+坎地沙坦组予溶于生理盐水的坎地沙坦(40 mg/kg)灌胃,SHR+TFB组予溶于生理盐水的TFB(240 mg/kg)灌胃,SHR+IGF-1组大鼠经侧脑室注射20μg/kg IGF-1,SHR+TFB+IGF-1组大鼠经侧脑室注射20μg/kg IGF-1后予240 mg/kg TFB灌胃,每日1次,连续12周。给药结束后,检测各组大鼠血压、左心室功能指标;HE和Masson染色观察组织病理变化;TUNEL染色观察组织细胞凋亡;试剂盒法测量抗氧化状态;RT-qPCR检测Ⅰ型胶原蛋白(CollagenⅠ)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、纤维连接蛋白(Fibronectin)和波形蛋白(Vimentin)mRNA水平;Western blot检测CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin、自噬标志蛋白(Beclin-1、LC3B、p62)、PI3K/Akt/mTOR信号通路蛋白水平。结果与SHR组相比,SHR+坎地沙坦组、SHR+TFB组大鼠左室射血分数(EF)、左室短轴缩短率(FS)明显升高,收缩压、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期内径(LVESD)、左室收缩末期容积(LVESV)、左心室质量指数(LVMI)明显降低,MF程度减轻,CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表达显著下调,凋亡小体百分比显著降低,谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)显著升高,内源性过氧化氢(H_(2)O_(2))、丙二醛(MDA)和活性氧(ROS)显著降低,Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ显著升高,p62表达显著降低,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著降低(P<0.05)。与SHR+TFB组相比,SHR+TFB+IGF-1组EF、FS明显降低,收缩压、LVEDD、LVEDV、LVESD、LVESV、LVMI明显升高,MF程度加重,CollagenⅠ、α-SMA、Fibronectin、Vimentin表达显著上调,凋亡小体百分比显著升高,GSH-Px、SOD、Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ显著降低,H_(2)O_(2)、MDA、ROS水平、p62表达及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值显著升高(P<0.05)。结论TFB显著降低SHR大鼠的收缩压,并通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活心肌自噬,降低氧化应激水平和心肌凋亡,进而减轻SHR大鼠的MF。

组胺对奶牛瘤胃上皮细胞mTOR自噬通路的影响

奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒时短链脂肪酸在瘤胃内大量积累,使瘤胃pH长时间为5. 0～5. 5,瘤胃内菌群紊乱,使组胺酸脱羧产生组胺的细菌增多,因而瘤胃内组胺浓度上升。瘤胃内自噬发生是清除异己,将体内的有害物排出以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新,是机体的重要功能。试验研究了不同时间及浓度组胺对奶牛瘤胃上皮细胞自噬的影响(时间点0,1,3,6,9,18 h;浓度0. 8,1. 6,2. 4 nmol/m L)。结果表明:不同浓度组胺刺激后瘤胃上皮细胞自噬雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)通路中关键蛋白磷酸化mTOR(pmTOR)和自噬降解底物(p62)表达量上升,mTOR、微管相关蛋白1轻链3(LC3)表达量下降。说明组胺高浓度时mTOR自噬通路受到抑制,使清除有害物质功能减弱,从而引起细胞损伤。

自噬相关基因mTOR信号通路在系统性红斑狼疮发病机制中的作用

目的自噬相关基因mTOR信号通路在系统性红斑狼疮(SLE)发病中的机制研究较少。文中旨在探讨自噬相关基因mTOR信号通路在SLE发病机制中的作用。方法选择2018年2月至2019年3月海南医学院第二附属医院风湿免疫科72例SLE患者(SLE组),另选取67例同期健康体检者为对照组。采用免疫印迹技术测定ENA抗体谱,包括:抗SSA、抗SSB、抗Sm、抗nRNP抗体、ds-DNA抗体等。采用IMMAGE蛋白分析仪测定IgG、IgA、IgM及补体C3、C4。采用实时荧光PCR技术测定自噬相关基因mTOR信号通路,分析2组自噬相关基因mTOR信号通路(PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA)与体液免疫水平的相关性。结果SLE组IgG、IgA、IgM水平明显高于对照组(P<0.05);补体C3、C4水平明显低于对照组(P<0.05)。SLE组患者PI3K mRNA、Akt mRNA、mTOR mRNA表达水平(0.52±0.06、0.61±0.08、0.48±0.05)明显低于对照组(1.00±0.09、0.89±0.07、0.95±0.08),差异有统计学意义(P<0.05)。SLE组PI3K、Akt、mTOR信号与IgG、IgA、IgM水平,及抗ds-DNA、SSA、SSB、Sm、nRNP抗体呈负相关(P<0.05);与补体C3、C4水平呈正相关(P<0.05)。结论SLE患者自噬相关基因mTOR信号通路呈抑制状态,其与免疫球蛋白和补体水平紧密相关。因此,检测自噬相关基因mTOR信号通路将有助于评估SLE患者病情状态。

MAP4K3-mTOR信号在甘草查而酮A诱导的鳞癌细胞自噬与凋亡中的作用研究

目的:探索MAP4K3-mTOR信号级联在甘草查而酮A诱导的人口腔鳞癌细胞自噬与凋亡中的作用。方法:分别采用0、25、50μmol/L甘草查尔酮A刺激人口腔鳞癌SCC-25系细胞,并于刺激后0、6及24h收集细胞,采用Western blot检测MAP4K3、AKT、mTOR通路分子,细胞自噬标识分子LC3-II、beclin1,以及细胞凋亡标记分子caspase-3、caspase-9及bcl-2等的蛋白表达水平,采用Annexin V-PI染色检测细胞凋亡状况。结果:甘草查尔酮A可剂量及时间依赖性地降低SCC-25细胞MAP4K3、p-mTOR及p-p70S6蛋白的表达水平,促进其LC3-II、beclin1、caspase-3及caspase-9蛋白表达水平,并抑制其bcl-2蛋白表达水平(P<0.05)。采用慢病毒过表达MAP4K3后,p-mTOR、caspase-3及caspase-9蛋白表达水平显著增高,LC3-II、beclin1及bcl-2蛋白表达水平则显著降低(P<0.05)。经甘草查尔酮A刺激后,SCC-25细胞早期凋亡数与晚期凋亡数均较对照组显著增多,该效应可被MAP4K3过表达处理显著增强(P<0.05)。结论:甘草查尔酮A可时间剂量依赖地抑制MAP4K3-mTOR信号级联,并促进人口腔鳞癌细胞的自噬与凋亡,当过表达MAP4K3活化mTOR信号级联后,鳞癌细胞自噬活动受到抑制,但其凋亡活动则显著增强。

青蒿琥酯对伴牙周病Ⅰ型糖尿病大鼠主动脉自噬功能调控机制研究

目的:评估伴牙周病Ⅰ型糖尿病大鼠主动脉组织中哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、微管相关蛋白轻链3(LC3)自噬信号通路基因表达情况,探究青蒿琥酯(ART)对自噬通路的调控作用。方法:选取56只SD大鼠,随机分为7组:正常对照组、单纯Ⅰ型糖尿病组(DM组)、单纯牙周病组(PD组)、伴牙周病Ⅰ型糖尿病组(DM+PD组)和伴牙周病I型糖尿病ART低剂量治疗组(DM+PD ART 10 mg/kg组)、中剂量治疗组(DM+PD ART 30 mg/kg组)、高剂量治疗组(DM+PD ART60 mg/kg组),每组8只。用药干预4周后,检测大鼠空腹血糖值,分离上颌牙槽骨、主动脉组织,Micro-CT检测牙槽骨吸收,实时荧光定量聚合酶链反应(q PCR)检测血管mTOR和LC3mRNA表达情况。结果:DM组、DM+PD组大鼠血糖值上升(P<0.01),通过ART治疗明显改善,其中DM+PD ART 60 mg/kg组作用明显。Micro-CT示PD组、DM+PD组牙槽骨出现明显吸收(P<0.01),ART用药组可有效改善,随浓度增加效果明显。qPCR结果显示,mTOR、LC3基因在各模型呈高表达,ART用药后表达明显减低,且呈浓度依赖性(P<0.05)。结论:ART通过抑制mTOR/LC3基因表达,调控伴牙周病I型糖尿病大鼠主动脉自噬功能。