基于PI3K/AKT/mTOR途径桔梗皂苷D对脑缺血再灌注诱导的血脑屏障的保护作用及机制研究

本研究旨在探讨桔梗皂苷D (Platycodin D,PLD)通过PI3K/AKT/mTOR途径对脑缺血再灌注诱导的血脑屏障的保护作用及机制研究。试验采用糖尿病Sprague-Dawley大鼠构建大脑中动脉闭塞模型。动物试验分组:sham组、HIR组、PLD组、3-MA组(3-甲基腺嘌呤,3-methyladenine)和PLD+3-MA组。分析各组大鼠神经功能缺损评分、脑含水量、脑梗塞体积和血脑屏障渗透性。透射电子显微镜观察血脑屏障超微结构变化和自噬。免疫印迹法分析紧密连接(Tight junction,TJ)蛋白(ZO-1、claudin-5和occludin)免疫荧光染色和蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)法,分析自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3B和p62)和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达。结果表明,PLD和自噬抑制剂3-MA治疗显著降低了脑梗死体积、脑含水量和伊文思蓝渗漏,同时增加了TJ蛋白的表达,降低了自噬相关蛋白的表达(P<0.05)。此外,PLD增加了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化水平。PLD通过抑制自噬预防高血糖条件下,脑缺血再灌注损伤后的血脑屏障损伤,可能通过调节PI3K/AKT/mTOR信号通路来实现。

香芹酚调节ERK/mTOR途径抑制宫颈癌细胞增殖及诱导细胞凋亡的作用研究

目的:探讨香芹酚可否通过介导ERK/mTOR途径抑制宫颈癌细胞增殖并诱导其凋亡。方法:宫颈癌HeLa和caski细胞分为空白对照组及香芹酚低(50μmol/L)、中(150μmol/L)、高(450μmol/L)浓度组,培养24 h, CCK-8法检测细胞增殖抑制率;克隆形成实验检测细胞的集落形成能力;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率;Hoechst 33258荧光染色检测细胞凋亡形态;Western Blot法检测细胞中p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR和LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平及cleaved Caspase-3、Bcl-2、Bax、Beclin-1、P62蛋白表达。结果:与空白对照组比较,香芹酚各浓度组HeLa和caski细胞增殖抑制率、凋亡率及cleaved Caspase-3、Bax、Beclin-1蛋白表达显著升高,细胞集落形成数显著减少,Bcl-2、P62蛋白表达及p-ERK1/2/ERK1/2、p-mTOR/mTOR、LC3Ⅰ/LC3Ⅱ水平显著降低(P<0.05)。结论:香芹酚可抑制宫颈癌细胞增殖并诱导凋亡,其作用机制可能与抑制ERK/mTOR途径进而促进癌细胞自噬发生有关。

氧化苦参碱对氧糖剥夺/复糖复氧损伤星形胶质细胞AMPK/mTOR途径及自噬的影响

目的探讨AMPK/mTOR通路调节的自噬在氧化苦参碱(oxymatrine,OMT)抑制氧糖剥夺/复糖复氧(oxygen-glucose deprivation and reperfusion injury,OGD/R)对星形胶质细胞(astrocyte,AS)损伤中的作用。方法将分离纯化AS随机分为对照组(CON组)、模型组(OGD/R组)和OGD/R+OMT组(0.1、0.2、0.4 mmol·L^(-1))。MTT法检测细胞存活率;Hoechst 33342和Annexin V-FITC法检测细胞凋亡;流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量;Western blot法检测p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR、Beclin 1、LC3B、p62和β-actin的表达。同时通过加入自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)探究自噬在OMT药效中作用。结果与CON组相比,OGD/R组细胞存活率明显降低(P<0.01),细胞凋亡率及细胞内ROS生成明显增加(P<0.01),p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/Ⅰ的比值及Beclin 1含量升高(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值及p62含量降低(P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+OMT组细胞存活率明显升高(P<0.01),细胞凋亡率减少(P<0.01),细胞内ROS生成明显减低(P<0.01),p-AMPK/AMPK和LC3BⅡ/Ⅰ的比值降低(P<0.01),p-mTOR/mTOR比值及p62含量升高(P<0.01)。与OGD/R组相比,OGD/R+3-MA组细胞存活率明显提高(P<0.01),同时OGD/R+3-MA组存活率与OGD/R+OMT及OGD/R+OMT+3-MA组相比均有明显差异(P<0.01)。结论OMT对OGD/R诱导的AS具有保护作用,其中作用与抑制AMPK/mTOR信号通路及改善自噬有关。

健脾祛痰化瘀方调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬防治动脉粥样硬化机制研究

目的探讨健脾祛痰化瘀方调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬防治动脉粥样硬化(atherosclerotic,AS)的机制。方法将40只ApoE小鼠随机分为模型组、阿托伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组,8只C57BL/6 Cnc小鼠作为正常组。除正常组给予基础饲料外,其余各组给予高脂饲料。造模12周后,灌胃给药,正常组与模型组给予相应体积的生理盐水,阿托伐他汀组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组给予相应药物。4周后全自动生物化学分析仪检测血清甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol,LDL-C)的含量;HE染色观察主动脉病理及斑块变化情况;采用透射电镜观察主动脉自噬体超微结构的变化;实时荧光定量Q-PCR法检测miR-155、LC3、Rheb、GAPDHmRNA的表达;采用Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测LC3、Rheb、p70s6k、p-p70s6k、mTOR、p-mTOR及β-actin蛋白的表达。结果与正常对照组相比,模型组ApoE小鼠血清中TG、TC、LDL-C水平均显著升高,HDL-C水平显著下降(P<0.01);HE染色结果显示模型组小鼠主动脉管腔中斑块面积范围较大、程度较重;电镜结果显示模型组小鼠主动脉超微结构自噬小体增多;模型组ApoEAS小鼠主动脉LC3-I、LC3-II、miR-155 mRNA表达显著下调(P<0.01),Rheb mRNA表达显著升高(P<0.01);模型组ApoEAS小鼠主动脉LC3-II/LC3-I显著下降(P<0.01),Rheb、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K蛋白表达显著升高(P<0.01)。经阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组治疗后,与模型组相比,阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组血清中TG、TC、LDL-C水平均发生显著性降低(P<0.01),HDL-C水平无明显变化趋势;HE染色结果显示阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组小鼠主动脉管腔中斑块面积范围明显减小、程度明显减轻;电镜结果显示阿托伐他汀和健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组小鼠主动脉超微结构显示自噬小体减少;阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组LC3-I、LC3-II、miR-155mRNA表达显著上调(P<0.01或P<0.05),Rheb mRNA表达显著下调(P<0.01或P<0.05);阿托伐他汀组以及健脾祛痰化瘀方药低、中、高剂量组LC3-II/LC3-I表达有所上调(P<0.01或P<0.05),Rheb、p-mTOR/mTOR、p-P70S6K/P70S6K蛋白表达显著下调(P<0.01或P<0.05)。结论健脾祛痰化瘀方可能通过调节miR-155/Rheb/mTOR途径介导内皮细胞自噬从而达到防治AS的作用。

miR-145通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性

目的探究miR-145调控非小细胞肺癌(NSCLC)A549细胞生物学特性及对雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号转导通路的影响。方法将A549细胞分为miR-145组、对照组、miR-145抗体组和对照抗体组。采用Lipofectamine;2000转染试剂盒进行质粒转染,行MTT、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭检测,Western blotting检测分析雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、磷酸化mTOR(p-mTOR)、真核细胞翻译起始因子(eIF4E)、磷酸化eIF4E(p-eIF4E)、核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、磷酸化p70S6K(p-p70S6K)、S6核糖体蛋白(S6)、磷酸化S6(p-S6)、eIF4E结合蛋白1(4E-BP)、磷酸化4E-BP(p-4E-BP)水平。结果对照组和对照抗体组细胞miR-145表达和细胞凋亡水平差异无显著性(P>0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最高,miR-145抗体组最低(P<0.05)。对照组和对照抗体组细胞增殖、迁移、侵袭活性,以及p-mTOR/mTOR、p-eIF4E/eIF4E、p-p70S6K/p70S6K、p-S6/S6、p-4E-BP/4E-BP表达水平差异无显著性(P>0.05),但与miR-145组和miR-145抗体组比较有明显差异,其中miR-145组最低,miR-145抗体组最高(P<0.05)。结论miR-145可通过mTOR途径调控NSCLC A549细胞生物学特性,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖活性、迁移能力及侵袭能力。

克唑替尼通过PI3K/AKT/mTOR途径抑制肺癌HCC78细胞系迁移的研究

目的基于PI3K/AKT/mTOR途径探索克唑替尼抑制肺癌细胞系HCC78细胞迁移的分子机制。方法采用MTT法检测细胞增殖抑制情况;Transwell迁移实验检测细胞迁移能力变化;ELISA实验检测细胞基质金属蛋白酶2(MMP-2)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)分泌变化;细胞免疫组化检测HCC78细胞Snail2含量变化;qPCR检测HCC78细胞E-Cadherin、N-Cadherin的mRNA表达情况;Western bloting检测HCC78细胞对PI3K、AKT、mTOR及p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的含量影响。结果克唑替尼可抑制HCC78细胞的增殖,具有时间-浓度依赖性,对HCC78细胞分泌MMP-2、MMP-9的能力具有显著的抑制作用(P<0.05),克唑替尼可抑制HCC78细胞中Snail2的激活,抑制其转录活性,降低HCC78细胞E-Cadherin、N-Cadherin mRNA表达及HCC78细胞内PI3K、AKT、mTOR的磷酸化含量(P<0.05),但并不影响PI3K、AKT、mTOR总蛋白含量。结论克唑替尼可抑制Snail2的表达激活,导致HCC78细胞中E-Cadherin表达上升,N-Cadherin表达下降,并下调HCC78细胞分泌MMP-2和MMP-9的能力,从而抑制HCC78细胞增殖和迁移,而引起上述蛋白表达变化的可能机制是克唑替尼可有效抑制PI3K/AKT/mTOR通路。

金匮肾气丸通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬在大鼠慢性阻塞性肺疾病中的作用

[目的]探究金匮肾气丸对慢性阻塞性肺疾病(COPD)的作用及其可能的作用机制。[方法]40只SD大鼠随机分为空白对照组、COPD组、金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组,每组各8只。除空白对照组外,其余组大鼠采用烟熏联合气管内滴注脂多糖(LPS)法建立COPD大鼠模型。各组给予相应药处理AniRes2005动物肺功能分析系统检测大鼠肺功能;酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒检测白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和白细胞介素-17(IL-17)水平;苏木精-伊红(HE)染色检测肺组织病理学变化;TUNEL染色检测肺组织细胞凋亡;蛋白质免疫印迹(Western blot)检测自噬及磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途径相关蛋白的表达。[结果]与空白对照组相比,COPD组大鼠肺功能降低,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显升高(P<0.05),炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显升高(P<0.05),p62和p-mTOR/mTOR蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与COPD组相比,金匮肾气丸3.7 g/kg组、金匮肾气丸7.4 g/kg组和地塞米松组大鼠肺功能升高,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17水平明显降低(P<0.05),炎症评分、细胞凋亡率和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-AMPK/AMPK蛋白表达水平明显降低(P<0.05),p62和p-m TOR/mTOR蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。[结论]金匮肾气丸可能通过AMPK/mTOR途径抑制肺组织细胞凋亡和自噬,延缓大鼠慢性阻塞性肺疾病进展。

甘草酮A通过调节mTOR/HIF-1α途径对顺铂诱导的肾小管上皮细胞的保护作用机制

目的:探究甘草酮A(Lico A)通过mTOR/HIF-1α途径对顺铂诱导的肾小管上皮细胞的保护作用及机制。方法:CCK-8检测HK-2细胞活性;试剂盒检测LDH活性及TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD、GSH-Px含量;TUNEL染色检测细胞凋亡率;Western blot检测凋亡相关蛋白及mTOR/HIF-1α通路蛋白表达。结果:CCK-8结果表明,Lico A对正常HK-2细胞无毒性,且增强了顺铂诱导的HK-2细胞活力(P<0.05);Lico A降低了顺铂诱导的HK-2细胞LDH活性,并降低了炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β和氧化应激因子MDA、SOD、GSH-Px含量(P<0.05)。TUNEL染色表明Lico A降低了顺铂诱导的HK-2细胞凋亡水平(P<0.05);Western blot结果表明Lico A降低了Bax蛋白表达,增加了Bcl-2蛋白表达,并降低了p-mTOR和HIF-1α蛋白表达(P<0.05);采用MHY1485和DMOG通路激活剂激活mTOR/HIF-1α通路后逆转了Lico A对HK-2细胞的保护作用,HK-2细胞活力降低,LDH活性及TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA、SOD、GSH-Px含量增加,细胞凋亡率降低,Bax蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05)。结论:Lico A通过抑制mTOR/HIF-1α途径保护顺铂诱导的HK-2细胞损伤。

PI3K/AKT/mTOR信号转导途径在嗜铬细胞瘤发生和发展中的作用及其联合靶向治疗

PI3K/AKT/m TOR信号途径在嗜铬细胞瘤的发生和发展中发挥着重要的作用。单独抑制其中某个靶点却会导致对于上游靶点的反馈激活以及平行信号途径的激活,导致肿瘤对针对这一信号途径抑制剂的抵抗。该文就PI3K/akt/m TOR信号通路在嗜铬细胞瘤发生和发展中的作用以及针对这一信号通路的靶向治疗,特别是多靶点多信号途径的联合靶向治疗的最新研究进展进行综述。

不同时间的热处理对大鼠肌肉Akt/mTOR信号途径的影响

热处理会诱导骨骼肌中肌肉蛋白的合成及肌肉肥大,同时刺激细胞信号途径.另外,有报道表明38℃以上的热处理以温度依赖性方式激活细包内信号途径.然而,骨骼肌细胞中热刺激对信号途径的持续性影响方面鲜有报道.因此,分析了热处理对大鼠骨骼肌中信号途径的作用.利用Western blot技术检测热处理后不同时间点(30,60和90min)的腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明,Akt及mTOR的磷酸化水平没有变化,磷酸化的p70S6K及4E-BP1水平有所上调,而热激蛋白HSP72的水平有所下调.

PTEN发挥生物学功能的信号传导途径及与子宫内膜异位症发病关系研究进展

第10号染色体同源丢失性磷酸酶—张力蛋白基因(PTEN)是一种可以调节多种生理和病理过程的抑癌基因,通过调节丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)/细胞外信号调节激酶(ERK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、IκB激酶(IKK)/核因子-κB(NF-κB)途径参与了多种疾病的发生与发展;MAPK/ERK途径不仅调控了细胞增殖,侵袭和转移过程,而且参与了细胞外基质降解和血管生成的过程;PI3K/AKT/mTOR途径促进细胞增殖和抗凋亡能力,并调节由血管内皮生长因子介导的血管生成;IKK/NF-κB途径可通过影响炎症因子的表达从而使盆腔微环境失衡。子宫内膜异位症是一种具有恶性行为的良性疾病,目前仍无有效的治疗手段,仅可通过药物或手术治疗缓解症状;异位内膜细胞中PTEN表达显著降低,促进了异位内膜的增殖和抗凋亡能力,并因其盆腔微环境失衡而使异位内膜细胞易于种植与存活;PTEN对血管生成的调节作用在异位内膜细胞的存活中亦发挥了重要的作用。

shRNA干扰NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Akt/mTOR信号通路的影响

本研究旨在探讨RNA干扰沉默NOTCH1基因对套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株的增殖、凋亡及Akt/m TOR信号通路的影响。针对NOTCH1基因设计短发夹RNA并将其连入p GPU6/GFP/Neo质粒中,构建NOTCH1 shRNA真核表达载体,经脂质体转染入Jeko-1细胞;应用RT-PCR及Western blot鉴定其干扰效果,M TT法绘制细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞凋亡的变化,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、procaspase-3、procaspase-9及Akt/m TOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-m TOR、p-P70S6K的表达。结果表明:NOTCH1 shRNA转染Jeko-1细胞后,NOTCH1基因的mRNA和蛋白表达均明显下调,有统计学差异(P<0.05);转染组增殖率明显低于NegshRNA组和空白组(P<0.05),NOTCH1 shRNA转染48 h后,凋亡率为(34.58±3.46)%,而Neg-shRNA组和空白组分别为(2.44±1.35)%、(1.72±0.64)%,有统计学差异(P<0.05);凋亡相关蛋白BCL-2、procaspase-3、procaspase-9的表达下调,而BAX表达上调;干扰NOTCH1基因后Akt总蛋白未见明显变化,而p-Akt、p-m TOR、pP70S6K的表达下降。结论:干扰沉默NOTCH1基因可抑制套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞增殖,诱导细胞凋亡,通过去磷酸化抑制Akt/m TOR信号通路可能是其机制之一。

紫檀芪调节PI3K/Akt/mTOR信号通路保护心肌缺血再灌注损伤大鼠的作用机制研究

目的构建心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)大鼠模型,观察紫檀芪对其的作用,并从磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路研究其作用机制。方法按随机数字法将清洁级SD大鼠72只分为假手术组、心肌缺血再灌注损伤组(MI/RI组)、紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组和阿司匹林组,每组12只。假手术组和MI/RI组给予10 mL/kg生理盐水灌胃治疗,紫檀芪低剂量组、紫檀芪中剂量组、紫檀芪高剂量组分别给予紫檀芪10 mg/kg、20 mg/kg和40 mg/kg灌胃,阿司匹林组则给予30 mg/kg阿司匹林灌胃,每日1次,连续灌胃2周。经冠状动脉左前降支结扎30 min,后再灌注2 h构建MI/RI模型,彩超检测心脏功能后处死,收集心脏检测心肌梗死面积、心肌组织病理学及心肌PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达水平,收集血液检测心功能肌酸激酶同工酶(CK-MB)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)及乳酸脱氢酶(LDH)活性,以及炎性因子白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量。结果与假手术组比较,MI/RI组左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)明显升高(P<0.05),左室短轴缩短率(LVFS)和左室射血分数(LVEF)明显降低(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均能降低LVESD(P<0.05),升高LVEF和LVFS(P<0.05),但LVEDD无明显变化(P>0.05);与假手术组比较,MI/RI组心肌梗死面积明显升高(P<0.05),紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均可明显降低梗死面积(P<0.05);与假手术组比较,MI/RI组心肌组织病理学可见有明显损伤,而紫檀芪低、中和高剂量组相较于假手术组损伤程度明显减轻;与假手术组比较,MI/RI组大鼠血清CK-MB、AST、LDH、IL-1β、IL-6和TNF-α均明显升高(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组均明显降低(P<0.05);与假手术组比较,MI/RI组PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平明显降低(P<0.05),而紫檀芪低、中和高剂量组和阿司匹林组均可有效提高PI3K、Akt和mTOR磷酸化水平(P<0.05)。结论紫檀芪对心肌缺血再灌注损伤大鼠心肌具有明显保护作用,其作用机制可能是通过激活PI3K/Akt/mTOR信号通路实现的。

不同温度热处理对大鼠骨骼肌Akt/mTOR信号通路的影响

热处理会诱导应急蛋白,从而促进细胞蛋白质合成并进一步导致肌肉肥大.但热处理对细胞内蛋白质合成中主要信号通路Akt/mTOR信号途径的影响鲜有报道.本研究分析了热处理对大鼠骨骼肌中Akt/mTOR信号途径的作用.利用Western blot技术检测了不同温度(37℃、38℃、39℃、40℃)的热处理对大鼠腓肠肌及比目鱼肌中Akt/mTOR信号途径蛋白Akt,mTOR,p70S6K及4E-BP1的磷酸化水平及热激蛋白HSP72的表达水平.结果表明39℃、40℃的热处理能够激活Akt及下游p70S6K的活性而对于热激蛋白HSP72的表达水平没有影响.

白头翁皂苷D对乳腺癌MCF-7细胞的体内外抗肿瘤作用研究

目的探讨白头翁皂苷D对人乳腺癌MCF-7细胞的体内外抗肿瘤作用及其机制。方法采用MTT法和吉姆萨染色,考察白头翁皂苷D对人MCF-7细胞体外增殖抑制的影响;建立MCF-7细胞裸鼠移植瘤模型,考察白头翁皂苷D体内抗肿瘤作用;HE染色和透射电镜实验考察肿瘤组织形态学和超微结构的变化;采用Western Blot法检测MCF-7细胞中Bcl-2、Caspase-3及PI3K/AKT/mTOR途径相关蛋白PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K的表达。结果白头翁皂苷D可抑制MCF-7细胞的增殖,且呈剂量依赖关系;裸鼠体内实验结果显示白头翁皂苷D可抑制肿瘤的生长,30.0 mg·kg^(-1)剂量组瘤体质量明显降低,与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);形态学观察结果也显示白头翁皂苷D对MCF-7细胞具有凋亡作用,且随着给药剂量的增加变化越明显;白头翁皂苷D(15.0,20.0,25.0μmol·L^(-1))不同剂量组均可抑制MCF-7细胞中Bcl-2、Caspase-3蛋白的表达,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01);白头翁皂苷D还可下调PI3K/AKT/mTOR信号传导通路相关蛋白PI3K-p85、p-AKT、p-mTOR、p-p70S6K蛋白的表达,20.0,25.0μmol·L^(-1)剂量组与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。结论白头翁皂苷D对MCF-7细胞有显著的体内外抗肿瘤作用,其机制可能是通过下调PI3K/AKT/mTOR信号传导通路诱导细胞凋亡。

姜黄素对大鼠肾系膜细胞结缔组织生长因子表达的影响

目的观察姜黄素对大鼠肾小球系膜细胞结缔组织生长因子(CTGF)表达的影响,并探讨其可能的影响机制。方法体外培养大鼠肾系膜细胞,同步后用血清刺激,并用不同浓度的姜黄素、姜黄素联合mTOR特异阻断剂雷帕霉素、姜黄素和磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)特异抑制剂LY294002进行干预处理。采用RT-PCR检测CTGF和纤维连接蛋白(Fn)mRNA表达;Western blot检测CTGF蛋白和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达。结果①血清刺激系膜细胞6 h,姜黄素浓度依赖性抑制CTGF和Fn mRNA的表达;姜黄素联合雷帕霉素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制作用较单用同浓度姜黄素明显;LY294002预处理后,姜黄素对CTGF和Fn mRNA表达的抑制作用较未预处理组减弱。②25μmol/L姜黄素作用细胞301、20 min,p-Akt蛋白表达较同时间点血清对照组明显减弱;且LY294002预处理后姜黄素对p-Akt表达的抑制作用较未预处理组亦明显减弱。③血清刺激系膜细胞24 h,姜黄素对CTGF蛋白的表达亦起抑制作用;姜黄素联合雷帕霉素对CTGF蛋白表达抑制更明显;LY294002预处理后,姜黄素对CTGF蛋白表达的抑制效果较未预处理组减弱。结论姜黄素可抑制血清刺激的肾小球系膜细胞CTGF的表达,其机制可能与PI3K/Akt信号途径和mTOR信号途径有关。

去酰基化ghrelin抑制上皮性卵巢癌细胞的增殖

目的探讨去酰基化ghrelin (DAG)对上皮性卵巢癌细胞增殖的作用及其相关分子机制。方法培养上皮性卵巢癌细胞SKOV3,以DAG处理,并予以激动剂干预哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)和经典Wnt信号途径,采用CCK-8法测定细胞增殖。结果DAG呈剂量依赖性抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖。DAG抑制m TOR信号途径,抑制经典Wnt信号转录活性以及下游靶基因的mRNA水平,mTOR和Wnt信号激活可在一定程度上翻转DAG对SKOV3细胞增殖的抑制作用。结论 DAG通过抑制m TOR和经典Wnt信号通路发挥其抑制卵巢癌细胞增殖的作用,为卵巢癌防治提供新思路。

下调Notch1基因促进人肝癌细胞系HepG2自噬

目的探讨Notch1基因对人肝癌细胞系HepG2的增殖、凋亡、自噬及Akt/mTOR信号通路的影响。方法选择于新乡医学院第三附属医院行肝癌手术治疗患者的肝癌组织32例,荧光定量PCR检测Notch1 mRNA的表达。构建Notch1 siRNA真核表达载体,经脂质体转染入HepG2细胞中,应用RT-qPCR及Western blot鉴定Notch1的干扰效果,MTT法检测细胞的增殖,流式细胞术检测细胞的凋亡率,Western blot检测凋亡相关蛋白BCL-2、BAX、cleared-caspase-3,自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5及Akt/mTOR信号通路相关蛋白Akt、p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K的表达。结果Notch1基因在原发性肝细胞癌组织中的相对表达量(1.865±0.791)显著高于癌旁组织(0.709±0.414)(P<0.001)。Notch1 siRNA转染HepG2细胞后,Notch1 siRNA组中Notch1 mRNA及蛋白的表达均显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。Notch1 siRNA组24、48、72及96 h的细胞增殖率显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。转染48 h后,Notch1 shRNA组细胞的凋亡率及Bax水平显著高于NC siRNA和对照组,而Bcl-2、cleaved caspase-3的表达显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。Notch1 siRNA组细胞中自噬相关蛋白LC3B、Beelinl、ATG7、ATG5的表达量显著高于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。而Notch1 siRNA组的p-Akt、p-mTOR、p-P70S6K表达量显著低于NC siRNA组和对照组(P<0.001)。结论下调Notch1基因的表达可显著抑制肝癌HepG2细胞的增殖,诱导细胞的凋亡,提高细胞的自噬水平,其机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路有关。

桔梗皂苷D联合伊马替尼对K562细胞的增殖抑制作用及机制研究

目的探讨桔梗皂甙D(platycodin,PD)与伊马替尼(imatinib,IM)联合用药抑制慢性粒细胞白血病细胞株K562的作用及机制研究。方法体外培养CML细胞株K562,CCK-8测定PD和IM单药及联合用药对K562细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪检测Annexin V/PI标记的细胞凋亡率,Western blot方法检测cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、PARP、cleaved PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白表达。结果联合用药组对K562细胞的增殖抑制作用和诱导细胞凋亡率较单独用药组效果明显,差异均有统计学意义(均P<0.01)。与单药组比较,联合用药组可以明显上调cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、cleaved PARP蛋白表达,同时下调PARP、Bcr/abl、p-AKT、p-m TOR蛋白的表达,差异均有统计学意义(P<0.01或0.05)。结论 PD与IM联合用药在抑制细胞增殖、诱导凋亡、抑制Bcr/abl蛋白和PI3K/AKT/m TOR信号通路方面明显优于单独用药。

富马酸二甲酯对糖尿病肾病自噬及足细胞功能的影响

目的探究富马酸二甲酯(DMF)对糖尿病肾病(DN)自噬及足细胞功能的影响。方法通过对大鼠腹腔注射50 mg/kg的STZ诱导了DN模型,DN组大鼠灌胃2 mL生理盐水,DN+25DMF组、DN+50DMF组和DN+75DMF组分别灌胃25、50和75 mg/(kg·d)的DMF,共治疗12周。检测各组大鼠的血糖、尿蛋白、血清尿素氮和肌酐水平。用Periodic Acid-Schiff(PAS)试剂盒对肾脏进行染色。通过Western blot或免疫荧光染色检测肾脏中nephrin、LC3、p62、p-AMPK、AMPK、p-mTOR、mTOR和p-ULK1的表达。此外,将小鼠足细胞系(MPC5)在高葡萄糖(HG,40 mmol/L)条件下用不同浓度的DMF(10、50和100μmol/L)处理24 h或36 h。使用CCK-8试剂盒测定细胞活力,通过Western blot测定细胞中的LC3和p62蛋白表达水平。结果与DN组比较,DN+25DMF、DN+50DMF和DN+75DMF组大鼠的血糖、尿蛋白、血清尿素氮和肌酐水平显著降低,肾小球系膜基质明显减少,肾组织中nephrin的表达水平显著升高(P<0.05)。与DN组比较,DN+25DMF、DN+50DMF和DN+75DMF组大鼠肾组织中LC3II的表达水平显著升高,而p62显著降低,大鼠足细胞中的自噬体数目显著升高(P<0.05)。与DN组比较,DN+25DMF、DN+50DMF和DN+75DMF组大鼠肾组织中AMPK、mTOR和ULK1磷酸化显著升高(P<0.05)。与HG组比较,HG+10DMF、HG+50DMF和HG+100DMF组MPC5足细胞的活力显著升高,LC3-II蛋白表达水平显著升高,而p62显著降低(P<0.05)。结论DMF通过AMPK/mTOR/ULK1途径增强自噬,从而抑制了DN的进展并提高了足细胞功能。