mTSARG3真核表达载体的构建及其稳定转染细胞系的建立

目的:构建小鼠mTSARG3基因真核表达载体,转染小鼠精原细胞系GC-1,建立稳定转染mTSARG3的GC-1细胞系,利用流式细胞技术(FCM)进行初步功能研究。方法:应用RT-PCR从小鼠睾丸cDNA文库中扩增mTSARG3的开放阅读框(ORF),并将PCR产物插入到pGEM-TEasy载体中测序验证。随后,经NotI和Hind III酶切后将目的片段进一步克隆到pcDNA3.1 Hygro(-)真核表达载体中。将经过测序验证的pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒转染GC-1细胞,通过潮霉素筛选建立mTSARG3稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测mTSARG3在稳定转染的GC-1细胞系中的表达;FCM观察转染pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3重组质粒)对GC-1细胞周期和凋亡的影响。结果:成功构建了pcDNA3.1 Hygro(-)/mTSARG3表达质粒,建立了稳定转染的GC-1细胞系。RT-PCR和Western blot检测结果发现,mT-SARG3在GC-1细胞系中成功表达。进一步通过FCM检测分析发现,转染mTSARG3可促进GC-1细胞增殖,抑制细胞凋亡。结论:mTSARG3真核表达载体的成功构建和稳定转染重组质粒GC-1细胞系的建立为进一步体外研究mTSARG3的功能奠定了基础。