小鼠卵透明带3(mZP3) cDNA的克隆、测序及mZP3 DNA疫苗的构建

卵透明带 3 (ZP3 )蛋白是透明带中的一种主要蛋白 ,在精卵结合过程中作为精子的初级受体起重要的作用 ,抗 ZP3抗体可以阻断精卵的相互作用 ,ZP3被认为是一种潜在的避孕疫苗的靶抗原。本文根据小鼠卵透明带(m ZP3 ) c DNA序列 (1 3 1 7bp)设计了上游和下游引物 ,从小鼠卵巢中提取总 RNA,经 RT-PCR克隆了鼠卵透明带 3基因的 c DNA,将其亚克隆至 p UCm-T载体后利用蓝白斑特性筛选出阳性克隆 ,酶切鉴定后测序比较 ,与Gene Bank小鼠 ZP3 c DNA序列完全相同 ,证明克隆出正确的小鼠 ZP3 c DNA.将 m ZP3克隆至真核表达质粒p CMV4上 ,构建完成了 DNA避孕疫苗的载体 p CMV4-m ZP3 ,为应用

小鼠卵透明带3(mZP3)质粒DNA体外瞬时表达的研究

为探讨小鼠卵透明带 3 (mZP3 )质粒DNA在真核细胞中的表达效率 ,筛选出高效表达mZP3的质粒 DNA ,提高DNA疫苗对小鼠的免疫不育效果 ,本研究采用阳离子多聚糖 纳米颗粒Puchio为转染介质 ,将mZP3质粒DNA转染真核细胞COS 7,用半定量 PCR检测mZP3的特异性mRNA表达。结果显示 :Puchio与pcDNA3 mZP3紧密结合 ,在COS 7细胞中有mZP3基因的特异性mRNA表达 ;Puchio的介导可能提高真核细胞的转染效率 ,有助于通过真核细胞的瞬时表达系统筛选出用于小鼠免疫不育的DNA疫苗 ,为深入开展鼠卵透明带

鼠透明带3(ZP3)融合蛋白表达以及抗血清制备

鼠透明带 3(mZP3)作为精子的初级受体 ,是鼠透明带中的一种主要糖蛋白 ,抗鼠透明带 3抗体能够阻断精卵的结合 ,达到不育的效果 ,因此mZP3是免疫避孕研究的重要候选抗原。从小鼠卵巢中提取总RNA ,分离mRNA ,反转录获得cDNA ,将cDNA连接到测序载体pUCm -T质粒上 ,通过序列测定和分析得到正确的mZP3cDNA。经内切酶EcoRI和XhoI处理 ,将mZP3cDNA克隆至融合蛋白表达载体pGEX - 4T - 1中 ,在T4DNA连接酶的作用下构建出融合表达载体pGEX -mZP3,转化大肠杆菌BL - 2 1菌株 ,利用IPTG诱导后获得可溶性的蛋白质产物 ,经过SDS -PAGE鉴定 ,表达的融合蛋白GST -mZP3分子质量约为 72kD左右 ,纯化的融合蛋白免疫兔子 ,获得效价为1∶1 0 0 0的抗血清 ,Westernblot检测抗血清具有针对mZP3融合蛋白的专一性 。

小鼠卵透明带3基因疫苗体外瞬时表达的研究

运用基因重组技术 ,将小鼠 ZP3c DNA片段克隆到真核表达载体 p CDNA3上 ,成功构建了 p CDNA3- ZP3真核表达质粒 ,转染 He L a细胞后 ,EL ISA法检测到 p CDNA3- ZP3真核表达质粒在 He L a细胞瞬时表达系统中能够特异性表达ZP3蛋白 ,结果表明 p CDNA3-