Application Value of Macrogene Ⅱ Sequencing in IPA Diagnosis and Treatment

Infectious diseases feature multiple pathogens,complicated and diverse clinical symptoms.Early and accurate detection of infectious pathogens sets the foundation for its targeted clinical treatment.With long detection cycles and low positive rates,traditional detection approaches such as Gram-stained smear microscopy and specific marker detection can barely meet the clinical needs for infectious disease detection.As a new gene detection technology,macrogeneⅡsequencing can enable higher detection efficiency for infectious diseases caused by pathogens such as fungi and bacteria,demonstrating certain application value.This paper describes invasive pulmonary aspergillosis(IPA),concepts concerning macrogeneⅡsequencing,as well as its application value for invasive pulmonary aspergillosis.

中国境内不同地理型东方蜜蜂线粒体DNA tRNA^(leu)～COⅡ基因多态性研究

【目的】从线粒体水平上探讨中国境内不同地理型东方蜜蜂的系统发育关系,为东方蜜蜂亚种分化的研究及我国境内东方蜜蜂资源的保护与合理开发利用提供基础资料。【方法】采用公开的E2、H2引物对11个不同地理型东方蜜蜂线粒体DNA tRNAleu～COⅡ基因进行了PCR扩增、测序,并利用相关软件和网站进行了序列比较分析。【结果】该序列长度为471bp;序列中共有9个位点发生变异;序列相似性均在99%以上;限制性酶切分析表明:云南保山东方蜜蜂缺少一个SwaⅠ酶切位点;部分编码蛋白序列比对表明,海南海口和吉林安图东方蜜蜂各有一个氨基酸发生变异。与GeneBank上公开登录的国内外有关东方蜜蜂相关序列的比较表明,单纯利用非编码区序列对比,不能把日本蜜蜂同中国大陆的东方蜜蜂区别开来;COⅡ基因部分序列对比显示,东方蜜蜂的线粒体类型包括:日本-韩国型、中国大陆型、中国台湾型、马来西亚沙巴州-印度黑色蜜蜂型、中国海南型、印度黄色蜜蜂型、泰国南部型和印度黑色蜜蜂型。【结论】中国境内不同地理型东方蜜蜂存在着较明显的遗传分化,其中海南东方蜜蜂由于长期的海岛隔离形成了一个独特的类群,支持了通过形态学认定的海南东方蜜蜂为东方蜜蜂的一个新亚种的观点。本研究部分测序结果已在美国国家生物信息中心(NCBI)网站GeneBank上登录,登录号为:DQ385854,DQ388602～DQ388609。

黄瓜花叶病毒亚组Ⅰ和Ⅱ分离物外壳蛋白基因的序列分析与比较

对我国分离的经生物学和血清学鉴定为黄瓜花叶病毒（ＣＭＶ）亚组Ⅰ和Ⅱ的各一分离物（ＧＢ、ＸＢ）的外壳蛋白（ＣＰ）基因进行了序列分析和比较。以提纯病毒ＲＮＡ为模板，进行逆转录及ＰＣＲ扩增，并通过常规基因克隆方法得到插入ＣＰ基因片段的重组克隆。对插入ＧＢ和ＸＢ两个分离物ＣＰ基因片段的重组克隆进行全序列测定，结果表明重组克隆序列长分别为７７７ｂｐ和７９２ｂｐ，均只含一个开放读框（ＯＲＦ），长度为６５７ｎｔ，可编码２１８个氨基酸；两个分离物的ＣＰ基因核苷酸序列同源率为７７５％，氨基酸序列同源率为８２６％。与我国已报道的７个ＣＭＶ分离物的ＣＰ基因序列比较，分离物ＧＢ的同源率为９１３％～９７３％，分离物ＸＢ的同源率为７６６％～７８４％。与国际上已报道部分ＣＭＶ株系的ＣＰ基因序列相比较，分离物ＧＢ与亚组Ⅰ株系有更密切的亲缘关系，而分离物ＸＢ则与亚组Ⅱ株系的亲缘关系更密切。

云南野生稻中Xa21基因外显子Ⅱ的分离及序列分析

Xa21是已经分离克隆的一个具有广谱抗性的水稻白叶枯病抗性基因,根据已克隆的白叶枯病抗性基因Xa21外显子Ⅱ序列设计特异性引物对云南3种野生稻及其他稻种进行PCR扩增。结果表明,只有普通野生稻(景洪普通野生稻和元江普通野生稻)及长雄野生稻中扩增到了长400bp的目的片段,而疣粒野生稻和药用野生稻及栽培稻中均没有扩增到目的片段。通过序列比较发现所克隆的序列同长雄野生稻的氨基酸序列变化是随机的。

中国人Ⅱ型MPS家系IDS基因的一种新突变的鉴定

为了研究粘多糖贮积症Ⅱ型(MPSⅡ)患者发病的分子遗传学机制,以便为今后的产前基因诊断等创造必要的前提条件,文章先采用尿糖胺聚糖(GAGs)定性检测法对疑似MPSⅡ的先证者进行初诊,然后采用PCR、PCR产物直接测序法对先证者及其家系成员进行突变检测。在检出IDS基因c.876del2新突变后,对随机采集的120例正常对照和其他非II型MPS患者包括MPSⅠ,Ⅳ,Ⅵ三型的病人共15例的IDS基因exon6进行序列分析,同时采用不同物种突变点序列的保守性分析法,以及直接测定患儿及其家庭相关成员IDS酶活性的方法对该新突变进行致病性分析。结果显示:先证者尿检呈强阳性(GAGs+++);其IDS基因exon6编码区内存在c.876-877delTC新缺失突变,为半合子突变,而其母、其姐为杂合突变;正常对照和其他非II型MPS患者的IDS基因exon6的检测结果均未发现该突变;不同物种氨基酸序列的同源性比对显示:c.876-877delTC突变所在的位置即p.292-293的苯丙氨酸(F)谷氨酰胺(Q)高度保守;酶活性测定的结果显示:先证者的IDS酶活性仅为2.3nmol/4h/mL,大大低于正常值,而其父的为641.9nmol/4h/mL,其母的血浆酶活性为95.8nmol/4h/mL,其姐的为103.2nmol/4h/mL。说明所发现的c.876-877delTC缺失移码突变是一种新的病理性突变,是该MPSⅡ患儿发病的根本内因。

扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元的克隆及序列分析

3头扬子鳄血样取自宣城安徽省扬子鳄繁殖研究中心。利用一对简并引物对MHCⅡ类B基因第二外元的部分片段进行扩增 ;通过克隆、单链构象多态性分析、测序 ,并将测得序列与下载的 8个物种MHC序列比对 ,确定序列差异和变异位点 ;利用MEGA软件构建NJ树 ,PAUP4 0构建MP树。结果得到 10种不同的序列 ,片段长 16 6bp。核苷酸序列中有 38个变异位点 ,氨基酸序列中有 2 3个变异位点 ;推定的抗原结合位点非同义替换 (dN)明显高于同义替换 (dS)。 10种序列的NJ树和MP树极为相似 ,均为A、B两个分支 ,两个分支明显的特异性位点核苷酸序列中有 9个 ,氨基酸序列中有 7个。表明扬子鳄MHCⅡ类B基因第二外元有较高的多态性 ,有利于扬子鳄饲养种群的遗传保护。

云南2株基因Ⅱ型新城疫病毒F基因变异特性分析

对云南省2个发病鸡场的组织病料进行病原分离，通过血凝、血凝抑制试验和RT-PCR检测，证明分离毒株为新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）。采用特异性引物经RT-PCR扩增F基因，纯化后克隆至pMD18-T载体，并对其进行测序。序列比对及系统发育分析结果表明，分离获得的云南省2株NDV毒株F基因核苷酸与La Sota株的核苷酸同源性为99．4％～99．6％，与国内外分离的流行毒株SP13和NDV027344核苷酸同源性均为99．7％～99．8％，与F48E9株的核苷酸同源性为89．0％～89．1％；F蛋白氨基酸与La Sota株的氨基酸同源性为99．3％～99．5％，与流行毒株SP13和NDV027344的氨基酸同源性均为99．5％～99．6％，与F48E9株的氨基酸同源性为91．8％～92．0％。系统发育分析结果表明，2株病毒均属于基因Ⅱ型，裂解位点氨基酸为G-R-Q-G-R L，属于弱毒株裂解位点氨基酸排列特征。

HLA-Ⅱ血清学分型与微量SSP法基因分型的比较分析

目的验证微量序列特异性引物(SSP)技术进行HLA-Ⅱ类移植配型的准确性并探讨血清学分型错误发生的原因。方法采用聚合酶链反应结合微量SSP技术(简称微量PCR-SSP法)以及单克隆抗体血清学分型技术对血清样品进行HLA分型并比较其结果。结果(1)微量PCR-SSP法检测的110例样本中,99例检出HLA-DR的396个等位基因、11例检出HLA-DQ的22个等位基因,检出10%的单倍型个体;(2)两种方法对比研究发现单克隆抗体血清学分型检出错误或漏检率较高,其误差在DR和DQ分别为38.81%和50.75%;(3)错误发生和易混淆的抗原为:DR15/16、11/12、13/14、8、12和DQ5/6、8/9。结论微量SSP法可以准确检定血清学易漏检和发生错误的抗原等位基因。

星斑川鲽MHC Ⅱ恒定链Ii基因的克隆和表达特性

为了研究星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用及调控机制,实验通过SMART-RACE技术克隆得到了星斑川鲽MHCⅡ恒定链(MHCⅡIi)的全长cDNA序列,其长度为1766 bp,包含135 bp的5′非编码区、837 bp的开放阅读框和794 bp的3′非编码区。该基因共编码279个氨基酸。理论分子量为30.848 ku,等电点为6.89。与已知物种MHCⅡIi进行同源性比对,结果与狼鲈、紫红笛鲷和鳜关系较近,同源性均为79%。利用quantitative realtime PCR(qRT-PCR)技术检测了MHCⅡIi在星斑川鲽不同组织中的表达,以及爱德华氏菌感染前后对该基因在不同组织中表达水平的影响,结果显示:在脾脏、头肾、肝脏、后肠、性腺、心脏、血液、鳃和肌肉组织中,MHCⅡIi mRNA均有表达,但在表达量上有明显差异,脾脏和头肾组织相对表达水平较高,鳃、血液、肌肉、心脏和性腺中的表达水平较低。病原感染后,免疫相关组织脾脏和头肾的表达水平升高最明显,肝脏和后肠的表达水平也略有升高,但变化不明显。本研究可为星斑川鲽MHCⅡ类分子的作用机理提供理论依据,同时为海水养殖鱼类的抗病遗传育种工作提供研究基础。

基于DNA拓扑异构酶Ⅱ基因部分序列的侧耳属系统发育分析

对侧耳属(Pleurotus)14个种的14个菌株,亚侧耳属(Hohenbuehelia)1个种和离褶伞属(Lyophyllum)1个种的DNA拓扑异构酶II(EC5.99.1.3)部分序列进行扩增分析。以灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)和玉米黑粉菌(Puccinia polysora)等担子菌为外群,采用最大距离法、最大简约法和最大似然法构建侧耳属的系统发育树。结果表明:作为外群的3个物种独立于所有供试材料;侧耳属菌株作为一大类与供试的离褶伞属和亚侧耳属分开。侧耳属14个种又可细分成6支:可能为侧耳属起源最早的P.flabellatus、P.salmoneostramineus和P.djamor组成一组;P.tuberregium和P.pulmonarius均自成一组;P.abalonus和P.cystidiosus均产生束梗孢,聚为同组;P.eryngiivar.eryngii、P.eryngiivar.ferulae和P.nebrodensis为一组;另一组由P.ostreatus、P.columbinus、P.cornucopiae和P.citrinopileatus组成。按照侧耳属物种菌丝类型的不同,构建的系统发育树将该属14个种进行系群划分,单、二系菌丝分属于各个不同的分支中,说明单、二系菌丝均为多系起源,与用28S rDNA序列进行系统分析的结果一致。

mtDNA COⅡ基因序列应用于赤眼蜂分子鉴定的研究

【目的】赤眼蜂(Trichogrammaspp.)是全世界害虫生物防治中研究最多、应用最广的一类卵寄生性天敌,赤眼蜂蜂种的正确鉴别是取得良好防治效果的关键。【方法】通过对松毛虫赤眼蜂(Trichogrammadendrolimi)、玉米螟赤眼蜂(T.ostriniae)、螟黄赤眼蜂(T.chilonis)、短管赤眼蜂(T.pretiosum)、卷蛾赤眼蜂(T.cacoecia)5种赤眼蜂,及松毛虫赤眼蜂(T.dendrolimi)、玉米螟赤眼蜂(T.ostriniae)、螟黄赤眼蜂(T.chilonis)的不同地理种群的细胞色素氧化酶Ⅱ(mtDNACOⅡ)基因序列片段的测定,并调用GenBank中微小赤眼蜂T.minutum、T.plantneri的同源序列,对不同种赤眼蜂的mtDNACOⅡ序列进行了多重排比和聚类,探讨了mtDNACOⅡ用于赤眼蜂不同种系统进化分析及分子鉴定的可行性。【结果】序列分析结果表明,不同地理种群赤眼蜂的遗传距离均小于0.66%,不同种赤眼蜂间的遗传距离在2%～7.6%之间。【结论】COⅡ基因序列在赤眼蜂种内非常保守,而种间存在明显的遗传差异,可以用作赤眼蜂种的分子鉴定。

日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚基的序列分析

目的 发现并克隆日本血吸虫新基因。方法 对已获得的日本血吸虫表达序列标签 (EST)进行同源性分析 ,识别血吸虫新基因 ;根据EST设计引物 ,用 3′RACE从mRNA中扩增获得新基因全长 ,用生物信息学技术对获得的编码基因进行结构与功能分析 ,将新基因的完整编码阅读框克隆入原核表达载体 pGEX -4T -1。 结果 用 3′RACE获得一个EST的 3′端所缺序列 ,得到完整编码阅读框 ,其开放阅读框 (ORF) 654bp ,编码 2 17个氨基酸。利用生物信息学技术确定其为日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位的编码基因。重组质粒经双酶切及测序鉴定 ,证明日本血吸虫CKⅡβ原核表达质粒构建成功。 结论 扩增并成功克隆日本血吸虫酪蛋白激酶Ⅱβ亚单位编码基因的全长cDNA 。

Ⅱ型胶原蛋白基因cDNA序列分析及其真核表达载体的构建

目的构建人Ⅱ型胶原蛋白(hCⅡ)基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。方法提取患者关节软骨组织总RNA,应用RT-PCR方法扩增出CⅡ基因片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体PcDNA3.1(+)中构建hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ,并进行PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果 PCR鉴定、酶切鉴定和序列分析表明CⅡ成功插入表达载体PcDNA3.1(+)。结论本研究成功构建了hCⅡ基因真核表达载体PcDNA3.1(+)/hCⅡ。

不同地理种群灰飞虱基于Co Ⅱ基因的系统发育分析

对9个灰飞虱地理种群的Co Ⅱ(Cytochrome oxidase Ⅱ基因进行克隆测序,并提交GenBank(EU728817～EU728826)。序列分析结果显示:不同灰飞虱地理种群的Co Ⅱ基因同源性非常高(99%以上),且无明显的种群差异;而灰飞虱和白背飞虱的Co Ⅱ基因的同源性相对较低(约80%),表现出了种间差异,表明Co Ⅱ基因可能不适合用于研究灰飞虱地理种群的划分,同时也说明Co Ⅱ基因较适合用于亲缘关系较近的种间系统发育研究。

乌龟MHCⅡ类B基因第二外显子的克隆及序列分析

利用一对兼并性引物扩增了乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子的部分片段,并对PCR产物进行了克隆和测序,结果得到8种长度为166 bp的不同序列。经分析,序列中有84个变异位点,核苷酸的非同义替换(dN)多于同义替换(dS),造成39个位点氨基酸的改变。氨基酸的替换趋于集中在假定的抗原结合位点附近。利用MEGA、PAUP软件分别构建NJ树和MP树,两种树极为相似,均分为两支。同一个体中出现有多种序列,提示乌龟MHCⅡ类分子B基因可能存在着座位重复。研究表明:乌龟MHCⅡ类分子B基因第二外显子有较高的多态性,有利于乌龟野生种群的遗传保护。

福建省1株登革Ⅱ型病毒的鉴定

目的对2005年福建省分离的1株登革病毒(DV)进行鉴定,并从分子水平追踪其可能的传染源。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测疑似登革热患者血清中DV(IgM、IgG抗体;同时应用C6/36细胞、单克隆抗体间接免疫荧光(McAb-IFA)、逆转录(套式PCR法分别进行病毒的分离和鉴定,并对分离株的部分基因进行核苷酸序列分析。结果患者血清登革病毒特异性IgM抗体阳性、IgG抗体可疑,表明该患者在近期感染过登革病毒。患者血清接种C6/36细胞,观察到登革病毒特有的CPE。受感染的C6/36细胞能与登革病毒Ⅱ型单克隆抗体反应,表明分离的病毒株为登革Ⅱ型病毒。分离株的核酸提取物经RT(PCR扩增,登革病毒通用引物可扩增出511bp的特异性条带,型特异性引物扩增出119bp的特异性条带,进一步证实分离的病毒株为登革Ⅱ型病毒。分离株RT(PCR扩增产物的核苷酸序列与30株不同地域来源的登革Ⅱ型病毒相应序列构建的系统发生树表明,此毒株与东南亚地区的毒株比较接近。此次分离株的序列与1999年登革Ⅱ型病毒福建株的对应序列在亲缘关系上有一定程度距离。结合流行病学调查资料,进一步确定此病例为输入性感染病例。结论福建省首次从输入性登革热患者血清中分离出登革Ⅱ型病毒,该病毒来源于东南亚地区。

日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ-p15亚单位的分离和序列分析

目的 分离和鉴定日本血吸虫 (Schistosomajaponisum ,Sj)新基因。 方法 应用表达序列标签 (Expressedse quencetags ,ESTs)法随机筛选SjcDNA文库 ,通过PCR直接序列测定技术和同源性比较对阳性插入片段进行鉴定。采用亚克隆技术和生物信息学分析对日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录延长因子SⅢ -p15亚单位进行结构和功能的鉴定。结果 我们从SjcDNA文库中随机筛选到一个cDNA克隆 ,它含有一个 371个碱基组成的阅读框 ,编码 118个氨基酸 ,与哺乳动物等的RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位具有较高的同源性 ,且具有该因子所特有的氨基酸序列 ,表明我们已经获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位。 结论 获得了日本血吸虫RNA聚合酶Ⅱ转录因子SⅢ - p15亚单位的全长cDNA序列 。

辽宁地区腹泻患者大肠杆菌分离株Ⅱ型不耐热肠毒素的检测及测序分析

目的对辽宁地区人源性腹泻样本中致病性大肠杆菌(Pathogenic Escherichia coli)的毒力因子进行检测,掌握产Ⅱ型不耐热肠毒素(Type Ⅱ heat labile enterotoxin,LT-Ⅱ)大肠杆菌在我国北方地区的流行现状并阐明LT-Ⅱ与其他致病因子间的关系。方法于2014年3月至2015年3月收集辽宁地区人源性腹泻粪便样品,用麦康凯培养基和生化试验的方法分离出大肠杆菌,并用多重PCR方法对毒力基因(elt-Ⅱ、elt-I、sta、stb、K88、K99等)进行检测,对分离到的LT-Ⅱ阳性大肠杆菌中elt-Ⅱ基因进行测序及分型。结果 354份腹泻样品中共分离到携带有毒力因子的大肠杆菌139株,检出率为39.2%。毒力因子阳性大肠杆菌中,有12株携带elt-Ⅱ(8.6%)基因。在12株携带elt-Ⅱ的大肠杆菌中,2株单独携带elt-Ⅱ,6株携带F1,1株携带K88,1株携带astA,2株携带irp2/astA;测序结果表明12株elt-Ⅱ阳性大肠杆菌中有10株携带elt-Ⅱc1亚型,2株携带elt-Ⅱc4亚型。结论在引起人源性腹泻的毒力因子中有大肠杆菌Ⅱ型不耐热肠毒的存在,且主要以LT-Ⅱc1为主要流行型。

CⅡTA基因启动子Ⅳ区G-944C多态性与慢性HBV感染发病易感性的关系研究

目的探讨MHCⅡ类反式激活因子(CⅡTA)启动子Ⅳ区G-944C基因多态性与慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染发病易感性的关系。方法在1203例慢性HBV感染无症携带与慢性肝患者中,应用序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)对CⅡTA基因启动子Ⅳ区G-944C位点进行基因分型研究。结果CC基因型频率在2组人群中分别为25·7%和19·7%,彼此间相差显著(χ2=5.560,P=0·018),而GC基因型频率分别为43.6%和49.9%,彼此间相差显著(χ2=4·774,P=0·029);在G基因显性模式下(C基因隐性模式),即GG+GC基因型频率在无症状携带和发病组人群中分别为74.3%和80.3%,两者间相差显著(χ2=5.560,P=0·018);在慢性肝炎、慢性重型肝炎和肝炎肝硬变3组人群中,C等位基因频率分别为44.1%、45.8%和45.0%,彼此间相差不显著(P>0.05)。结论CⅡTA基因启动子Ⅳ中的G-944C位点多态性与慢性HBV感染者发病易感性存在一定的关系,而与疾病的严重程度无明显关系;基因型为CC纯合子的慢性HBV感染者不容易发展成慢性肝病。

中国皮划艇、举重运动员线粒体高变区Ⅱ同质序列多态性分析

目的:通过对线粒体基因(mtDNA)高变区Ⅱ(HVR-Ⅱ)作序列多态性分析,探讨与人类运动能力相关的基因标记及其分子机制。方法:受试者均为中国汉人,其中皮划艇运动员123人,举重运动员70人,对照组132人。通过特异性扩增mtDNAHVR-Ⅱ片段并测序,分析其序列多态性变化。结果与结论:中国皮划艇、举重运动员和普通汉人对照的mtDNAHVR-Ⅱ具有很高序列多样性,遗传变异性大,遗传多样性丰富。3组人群mtDNAHVR-Ⅱ同质性序列多态性无显著性差异,并具有共同特征:(1)碱基替换频率高于重排频率,碱基替换以转换为主,碱基转换中以嘌呤转换为主,嘌呤转换中以A-G频率最高;(2)重排以碱基插入为主,其中插入C频率最高,其次为CC;(3)3组人群mtDNAHVR-Ⅱ与HVR-Ⅰ具有相似的碱基替换频率。在HVR-Ⅱ中,np73位点的A-G多态性频率具有明显的种族和地域差异。