NS1基因主要抗原区的可溶性表达及其DotELISA检测方法的建立

【目的】可溶性表达猪流感病毒(SIV)NS1基因主要抗原区(NS1′)蛋白,获得具有良好抗原性的NS1′蛋白,并初步建立检测NS1抗体的斑点酶联吸附试验(Dot-ELISA)方法,为鉴别诊断猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪奠定基础。【方法】以质粒pET28a-NS1为模板,PCR扩增NS1基因抗原性较好的区段NS1′,用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入pET-32a(+),构建pET32a-NS1′,经PCR、EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及DNA测序鉴定后,转化大肠杆菌Rosetta,用IPTG诱导表达,纯化NS1′并免疫家兔制备多克隆血清,对其进行SDS-PAGE、Western blotting检测和免疫荧光分析,并以纯化的NS1′作为包被抗原初步建立Dot-ELISA检测方法。【结果】PCR扩增获得了长约250bp的H3N2SIV NS1′片段;成功构建了重组载体pET32a-NS1′;SDS-PAGE和Western blotting检测结果显示,融合蛋白NS1′大小约34ku,该蛋白可溶,能与感染SIV的猪血清特异性反应,并且用纯化蛋白NS1′制备的多克隆血清能识别293T细胞中表达的NS1,建立的Dot-ELISA检测方法可鉴别猪流感病毒感染猪与疫苗免疫猪。【结论】实现了H3N2SIV NS1′蛋白的可溶性表达,表达产物具有良好的抗原性,以NS1′作为包被抗原,建立了检测NS1抗体的Dot-ELISA方法。

上海地区无偿献血者乙型肝炎病毒隐匿性感染情况和突变分析

目的了解上海地区无偿献血人群乙型肝炎病毒隐匿性感染的情况、病毒基因型的分布及S区氨基酸的突变情况。方法对上海市血液中心2011年10月～2012年7月使用血清学联合核酸检测所作的常规血液筛查结果进行分析,综合乙型肝炎血清学标志物二对半检测结果,以判断献血者HBV DNA+标本的感染状态,从中选择部分HBsAg-HBVDNA+的隐匿性HBV感染(OBI)标本作S区巢式PCR、克隆测序,基因分型和突变分析。结果从250 376(人)份无偿献血者标本中筛查出197例HBsAg-HBV DNA+,包括OBI 172例(0.069%);经S区巢式PCR的47例OBI标本中,有17例扩增出S区:14例为C亚型、突变率为35.71%(5/14),3例为B亚型,有1例发生突变,突变主要发生在S抗原的主要亲水区(MHR)。结论上海地区无偿献血者OBI携带率为0.069%,S抗原MHR区的突变可能是OBI发生的贡献因素之一。

猪细小病毒NS1非结构蛋白和VP2结构蛋白主要抗原区间接ELISA方法的建立与联合应用

为了建立猪细小病毒野毒抗体的NS1-i ELISA和猪群PPV免疫抗体水平的VP2-i ELISA方法,试验采用猪细小病毒NS1和VP2基因主要抗原区纯化后的原核表达重组蛋白作为包被抗原。结果表明:检测灵敏度为1∶12 800;批内、批间重复性试验变异系数均小于10%,NS1-i ELISA方法与HI试验的符合率为100%;VP2-i ELISA方法与HI试验的符合率为94.7%,且比HI试验具有更高的敏感性。用这两种方法同时检测猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪乙型脑炎病毒(JEV)和猪O型口蹄疫病毒(FMDV)6种常见猪病病毒的阳性血清结果均为阴性。说明所建立的NS1-i ELISA和VP2-i ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性。这两种方法可联合应于PPV野毒感染的快速诊断、流行病学调查、猪群免疫疫苗后PPV抗体水平的检测以及猪群PPV的净化。

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白主要抗原表位区的原核表达及抗血清制备

目的表达大鲵虹彩病毒(CGSIV)主要衣壳蛋白(MCP)主要抗原表位区蛋白,并制备兔抗血清。方法以大鲵虹彩病毒略阳株(CGSIV-LY)基因组为模板,PCR扩增MCP基因,然后克隆到p ET-21a(+)表达载体中,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot法检测重组蛋白的表达和免疫活性,用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化的重组蛋白为免疫原免疫兔制备抗血清,采用Western blot法和ELISA检测抗血清的免疫特异性并测定效价,利用间接免疫荧光法检测鲤鱼上皮瘤(EPC)细胞CGSIV。结果表达了相对分子质量(Mr)为29 000的重组蛋白。制备的兔抗MCP血清具有良好的特异性和高滴度,间接免疫荧光法检测结果显示制备的多抗血清能识别EPC细胞中的CGSIV。结论成功表达了大鲵虹彩病毒MCP主要抗原表位区蛋白,并制备高滴度和良好特异性的兔抗血清。

乙型肝炎病毒表面抗原118位氨基酸变异研究

目的研究献血者乙型肝炎病毒表面抗原118位氮基酸变异对ELISA检测的影响。方法PCR扩增献血者表面抗原基因,恢复变异点氨基酸为野生型,构建不同的表达载体,在293T细胞株中表达,检测各自在不同试剂中的反应格局。结果117位点对检测反应格局不产生明显影响,118位点的变异明显影响检测格局,恢复变异点氨基酸明显提高了检出率和灵敏度。结论118位氮基酸变异影响了乙肝表面抗原的筛查,改变了其的免疫反应原性。

猪细小病毒GZ分离株NS1基因主要抗原表位区原核表达研究

根据GenBank登录的猪细小病毒NADL-2株和China株NS1基因序列设计1对特异性引物,对贵州大学动物生物技术实验中心分离的猪细小病毒GZ株接种ST细胞传代培养后,提取病毒DNA,进行PCR扩增PPV NS1基因主要抗原表位区,克隆后测序,随后将该基因亚克隆至pET-32a(+)载体,构建pET-32a-NS1重组质粒,转化得到重组菌,经IPTG诱导表达,通过亲和柱纯化并复性,制备重组蛋白。Western-blot检测发现,经诱导表达的NS1基因主要抗原表位区蛋白约为64 ku,与预测的大小一致,而且,重组蛋白在纯化复性后能被PPV阳性血清所识别,具有较好的反应原性。

犬冠状病毒S蛋白主要抗原区基因片断的表达及免疫原性

应用 Pichia pastoris 酵母表达了犬冠状病毒大熊猫野毒株(CCV DXMV) S 蛋白主要抗原区基因片断。用特异性引物扩增出 CCV DXMV 株 S1 基因片断,并将其克隆到 pGEM-T 载体中得到 pTS1。用 Kpn I 和 NotI 双酶切pTS1 回收目的基因 S1 定向克隆到 pPICZαA 中,构建出重组质粒 pPICZαAS1。将 pPICZαAS1 用 Sac I 内切酶线性化后,电转化感受态 GS115 酵母细胞,用 PCR 法筛选阳性重组子。用 1%的甲醇诱导重组酵母菌,取培养物上清进行重组蛋白的检测。结果重组酵母菌培养物上清用 SDS-PAGE 电泳可检测到相对分子量为 106kDa 大小的重组蛋白, Western-blot 证实该重组蛋白可以与 CCV 多克隆抗体发生特异性血清学反应。凝胶薄层扫描分析表明,3 株重组酵母菌在 1%甲醇诱导 144h 后,重组蛋白 S1 表达量约占培养物上清总蛋白量的 6.6-8.6%左右。用重组蛋白 S1 免疫 BALB/C 小鼠 3 次后,小鼠血清 CCV 中和抗体可达 1:8-1:16,表明重组 S1 蛋白具有一定的免疫原性。

猪瘟病毒E_2基因主要抗原区的克隆及原核表达

利用反转录PCR(RT PCR)和套式PCR(nestPolymeraseChainReaction ,nPCR)技术扩增出当前猪瘟流行毒(广西玉林株 ,GXYL)与中国猪瘟兔化弱毒 (C 株 )兔脾组织毒E2 基因的主要抗原区 ,将其克隆到表达载体pPROEX HTb中 ,获得重组质粒pPROEX GXYL和pPROEX C ,经PCR、酶切和序列分析鉴定表明 ,插入的位置、大小和读码框均正确。SDS PAGE检测表明 ,经重组质粒pPROEX GXYL和pPROEX C转化、诱导的受体菌能表达E2 基因主要抗原区蛋白 ,Western blot检测表明 。

人源程序性死亡配体PD-L2蛋白的原核表达与抗血清制备

利用原核表达系统获得包涵体表达形式的重组蛋白h PD-L220~123(Ig V结构域)和h PD-L220~208(Ig V结构域和Ig C结构域);将重组蛋白利用Ni-NTA柱亲和层析纯化与复性后,作为免疫原免疫Balb/c雌性小鼠制备鼠抗人的多抗血清,经ELISA法检测其效价均达到1∶106;Western-blot实验结果表明,制备的多抗血清均能特异性识别h PD-L2蛋白.以制备的多抗血清进行IHC实验评估与鉴定,结果显示:以h PD-L220~123重组蛋白为免疫原制备的多抗血清阳性较弱且定位模糊,以h PD-L220~208重组蛋白为免疫原制备的多抗血清具有很强的膜定位且背景清晰.

猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达及Dot-ELISA建立研究

为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。