慢性丙型病毒性肝炎患者血清IL-26、25(OH)D水平变化及其临床意义

目的 探讨慢性丙型病毒性肝炎(chronic hepatitis C, CHC)患者血清IL-26、25(OH)D水平变化及其临床意义。方法 选取2022年1月至2023年1月中国人民解放军联勤保障部队第九八七医院收治的120例CHC患者作为研究组,选取我院同期健康体检者50名作为对照组,采用ELISA检测IL-26及25(OH)D水平。结果 与对照组相比,研究组患者血清中IL-26水平升高,25(OH)D水平降低(P<0.05);与F_(0)~F_(1)分级相比,F_(2)~F_(3)分级的CHC患者血清中IL-26升高,25(OH)D水平降低(P<0.05);与F_(2)~F_(3)分级相比,F_(4)分级的CHC患者血清中IL-26升高,25(OH)D水平降低(P<0.05);与高病毒载量组相比,低病毒载量组的CHC患者血清中IL-26降低,25(OH)D水平升高(P<0.05);治疗后,CHC患者血清中IL-26水平降低,25(OH)D升高(P<0.05);与不良预后患者的CHC患者相比,非不良预后的CHC患者血清中IL-26水平降低,25(OH)D水平升高(P<0.05);在CHC患者中IL-26、25(OH)D呈负相关(r=-0.766,P<0.001)。结论 CHC患者血清IL-26升高、25(OH)D降低,并与肝纤维化程度及HCV病毒载量有关。临床治疗后,可逆转这一现象。

昆虫杆状病毒表达的猪圆环病毒2d型Cap蛋白-VLP对仔猪的免疫保护效果

猪圆环病毒2d基因型(Porcine circovirus type 2d,PCV2d)为猪场当前流行的PCV2优势基因型,为了研究针对PCV2d基因型的病毒样颗粒(Virus-like particle,VLP)疫苗,提高猪圆环病毒病的防控效果。本研究利用杆状病毒表达系统表达了能够自组装为VLP的PCV2d-Cap蛋白,然后将9头21日龄健康仔猪随机分为VLP组、攻毒对照组和空白对照组(n=3)。VLP组的每头仔猪经颈部肌肉注射400μg Cap蛋白-佐剂复合物(PCV2d-VLP),攻毒组注射等体积的PBS与佐剂混合物,空白组注射等体积的PBS。共接种2次,每次间隔14 d。于第2次免疫后21 d,VLP组和攻毒对照组的仔猪通过鼻腔感染PCV2 HBDX-2018株(106TCID50/头),评价PCV2d-VLP诱导的免疫效果。结果表明PCV2d-VLP能够诱导仔猪产生高水平的特异性IgG抗体和中和抗体,刺激IFN-γ水平升高,引起外周血淋巴细胞增殖能力增强,降低病毒经鼻腔和直肠的排毒率及病毒血症阳性率,减轻腹股沟淋巴结和脾脏的病理损伤,降低组织中的病毒载量。上述研究表明,应用杆状病毒表达的PCV2d-Cap蛋白能自组装为VLP,并能诱导仔猪产生良好的免疫保护效应,具有进一步开发为PCV2d-VLP疫苗的潜力。

非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制

旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。

血清25羟维生素D水平与宫颈高危型人乳头瘤病毒感染及宫颈上皮内瘤变的关系

目的探讨血清25羟维生素D[25(OH)D]水平与宫颈高危型人乳头瘤病毒(hr-HPV)感染及宫颈上皮内瘤变的关系。方法选取行hr-HPV检查的体检女性志愿者1197例,其中hr-HPV阳性180例为阳性组、阴性1017例为阴性组;同时选取因宫颈筛查异常行阴道镜检查的患者437例,依据阴道镜检查结果及活检病理结果分为非宫颈上皮内瘤变组237例(正常宫颈131例、慢性宫颈炎106例)、宫颈上皮内瘤变组200例[低度鳞状上皮内病变(LSIL)93例、高度鳞状上皮内病变(HSIL)95例、宫颈鳞状细胞癌12例]。采用化学发光免疫法检测受试者血清25(OH)D水平,分别采用二元Logistic回归分析和多因素Logistic回归分析其对hr-HPV感染和宫颈上皮内瘤变的影响。绘制血清25(OH)D预测宫颈上皮内瘤变的受试者工作特征(ROC)曲线,分析其预测价值。结果阳性组和阴性组血清25(OH)D水平分别为38.00(13.03,131.43)、41.73(13.40,236.70)nmol/L,两组比较P<0.05;二元Logistic回归分析结果显示,血清25(OH)D水平降低是hr-HPV感染的独立危险因素(B为-0.013,SE为0.004,OR为0.987,95%CI:0.978~0.995,P<0.05)。宫颈上皮内瘤变组与非宫颈上皮内瘤变组血清25(OH)D水平分别为40.8(34.9,47.3)、45.1(38.25,55.15)nmol/L,两组比较P<0.05。宫颈上皮内瘤变组中LSIL、HSIL、宫颈鳞状细胞癌患者血清25(OH)D水平分别为43.5(37.1,50.5)、39.5(34.4,45.3)、30.6(21.3,37.8)nmol/L,两两比较P均<0.05;多因素Logistic分析结果显示,血清25(OH)D水平降低是影响宫颈上皮内瘤变的独立危险因素(P均<0.05)。ROC曲线分析结果显示,血清25(OH)D水平预测宫颈上皮内瘤变的最佳临界值为49.15 nmol/L,此时预测宫颈上皮内瘤变的敏感度为83%、特异度为41%、曲线下面积为0.628(95%CI:0.680~0.576,P<0.05)。结论血清25(OH)D水平下降可导致宫颈hr-HPV感染及宫颈上皮内瘤变的发生风险升高,血清25(OH)D水平有助于预测宫颈上皮内瘤变的发生。

A型塞内卡病毒3D蛋白原核表达及多克隆抗体制备

A型塞内卡病毒(SVA)是一种无囊膜的单股正链小RNA病毒,是塞内卡病毒属的唯一成员,其感染后可引起仔猪的急性死亡和母猪水泡样病变。SVA编码的非结构蛋白3D在病毒增殖及拮抗宿主天然免疫反应中发挥着重要的作用。本研究旨在原核表达SVA 3D蛋白,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体。以SVA RNA为模板,通过RT-PCR试验扩增3D基因,并将3D基因克隆至原核表达载体pCold-Ⅰ中,构建重组质粒3D-pCold-Ⅰ。将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达3D蛋白,纯化该重组蛋白后免疫BALB/c小鼠制备SVA 3D蛋白的多克隆抗体。结果显示,原核表达的SVA 3D蛋白是一种可溶性蛋白,其分子质量约为55 kDa。经Western blot和IFA试验鉴定,制备的SVA 3D多克隆抗体具有良好的反应性,本研究为SVA的基础研究和应用研究提供了工具。

猪圆环病毒Ⅱ型感染3D4/2细胞的转录组学分析

【目的】通过转录组测序筛选猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus typeⅡ,PCV2)感染猪肺泡巨噬细胞系(3D4/2)差异表达基因,为了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和抗PCV2感染药物研发奠定基础。【方法】用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为1的PCV2 NJ2002株处理3D4/2细胞,利用Illumina NovaSeq 6000测序平台进行转录组测序。使用DeSeq 2.0软件进行差异表达基因分析,并对差异表达基因进行基因本体论(GO)、京都基因与基因组百科全书(KEGG)功能分析及转录因子靶向分析,选取免疫及凋亡相关基因进行实时荧光定量PCR验证,用Western blotting技术检测细胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)及磷酸化胞内磷脂酰肌醇激酶(p-PI3K)、蛋白激酶B(Akt)和磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)蛋白表达水平。【结果】转录组测序结果显示,与对照组相比,PCV2感染组共获得713个差异表达基因,其中313个上调,400个下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,差异表达基因与免疫应答等相关,主要富集在细胞外基质受体互作通路、新陈代谢通路、HIF-1信号通路、病毒致癌作用、PI3K-Akt等信号通路。实时荧光定量PCR结果与转录组测序的基因表达水平保持一致。Western blotting检测结果显示,PCV2感染3D4/2细胞24 h后PI3K和Akt蛋白磷酸化水平显著升高(P<0.05)。转录因子靶向分析表明,差异表达基因与核转录因子Y亚基β(NFYB)和ETS转录因子(ELK4)联系紧密。【结论】PCV2可能通过PI3K-Akt信号通路影响下游炎症信号通路和凋亡信号通路增强自身复制能力。NFYB和ELK4转录因子在PCV2感染过程中可能发挥重要作用,可考虑作为抗PCV2药物靶点。研究结果为深入了解PCV2感染宿主免疫细胞机制和相关药物开发提供了理论基础。

人乳头瘤病毒16/18感染与膀胱癌组织cyclinD1、P53蛋白表达的相关性分析

目的 分析人乳头瘤病毒(HPV)16/18感染与膀胱癌组织细胞周期蛋白D1(cyclinD1)、P53蛋白表达的相关性。方法 采集62例膀胱癌患者的癌组织和癌旁组织。采用免疫组化染色和半定量积分方法,检测HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白在膀胱癌及癌旁组织中的表达水平,并分析其表达与膀胱癌临床病理特征的关系以及THPV16/18与cyclinD1、P53蛋白表达的相关性。结果 膀胱癌组织中,HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白的阳性率高于癌旁组织(P<0.05);HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白阳性率病理分级高、临床分级高、有远处转移的膀胱癌组织分别高于病理分级低、临床分级低、无远处转移的膀胱癌组织(P<0.05);HPV16/18阳性组cyclinD1和P53蛋白阳性率高于HPV16/18阴性组(P<0.05);膀胱癌组织中HPV16/18表达与cyclinD1表达无相关性(P>0.05),与P53蛋白表达呈正相关(P<0.05)。结论 HPV16/18、cyclinD1和P53蛋白均参与了膀胱癌的发生和发展,HPV16/18可以影响P53蛋白的表达,参与膀胱癌的进展。

深圳市新型冠状病毒感染者维生素D水平分析

目的:了解深圳市第三人民医院,即深圳市新型冠状肺炎定点救治医院收治的新型冠状病毒感染者维生素D的营养情况。方法:测定2021年12月13日至2022年2月25日因感染新型冠状病毒而入住深圳市第三人民医院患者的血清25羟基维生素D[25(OH)D]水平,比较不同年龄、性别人群25(OH)D营养水平,并与广东地区体检者进行比较。结果:深圳市新型冠状病毒感染者的25(OH)D水平男女之间比较,差异无统计学意义(P>0.05);<30岁年龄段患者的25(OH)D水平最低,40~49岁年龄段患者的25(OH)D水平最高,组间差异有统计学意义(P<0.05)。深圳市新型冠状病毒感染者的血清25(OH)D平均水平为(54.13±14.80)nmol·L^(-1),较广东地区体检者低,差异具有统计学意义(P<0.05),且新型冠状病毒感染者的维生素D充足率(8.7%)低于体检人群(25.9%),差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:深圳市新型冠状病毒感染者的维生素D水平普遍较低,低于广东地区体检人群水平,缺乏和不足人数众多,尤其<30岁年龄段者缺乏较严重,维生素D水平与新型冠状病毒感染可能存在相关性,考虑维生素D与健康有多种相关性,适当提高维生素D水平可能对健康有意义。

肾移植早期25-羟基维生素D水平对BK病毒感染风险的影响

目的探讨肾移植早期25-羟基维生素D[25(OH)D]水平对BK病毒(BKV)感染风险的影响,为肾移植术后BKV感染风险评估、早期预测及诊断和预防提供参考依据。方法选取2017年1月至2022年3月该院肾移植受者573例,随访移植术后1年内BKV感染情况,按照相关文献获得肾移植早期25(OH)D缺乏或不足的发生率;分析肾移植术后早期25(OH)D缺乏或不足与BKV感染的相关性及对其风险的影响,以及肾移植术后早期25(OH)D水平对BKV感染的早期预测及诊断价值。结果(1)该研究BKV感染发生率为56.9%(326例),其中BKV尿症为56.7%(325例)、BKV血症为7.90%(45例)、BK病毒相关性肾病(BKVAN)为0.35%(2例)。(2)25(OH)D缺乏或不足发生率为71.8%(411例),其中25(OH)D缺乏组占比为37.2%(213例),不足组占比为34.6%(198例)。(3)BKV未感染、BKV尿症、BKV血症中,25(OH)D缺乏和不足发生率依次逐渐增高,25(OH)D正常率逐渐减低,差异有统计学意义(P<0.05)。(4)多因素Logistic回归分析显示,男性、25(OH)D缺乏或不足是BKV感染的独立危险因素(P<0.05)。(5)受试者工作特征(ROC)曲线分析表明,肾移植早期25(OH)D水平预测及诊断术后BKV感染的曲线下面积(AUC)为0.781(95%CI:0.742~0.819),截断值为15.45 ng/mL,联合性别后AUC为0.818(95%CI:0.772~0.844)。结论该院肾移植术后1年内BKV感染发生率较高,移植早期25(OH)D缺乏或不足普遍存在,是BKV感染的独立危险因素,且25(OH)D水平对BKV感染有一定早期预测、诊断价值。临床应重视肾移植早期25(OH)D水平的监测与补充,从而有效降低BKV感染风险。

不同谱系D型流感病毒HEF蛋白N-糖基化位点和B细胞表位预测分析

D型流感病毒(IDV)是一种近年来新发现的正粘病毒科D型流感病毒属成员,可引起牛、猪、豚鼠等多种动物的呼吸道疾病,具有潜在的人兽共患性。基于HEF基因遗传多样性,IDV可分为5个不同的谱系,分别是D/OK、D/660、D/Yama2016、D/Yama2019和D/CA2019谱系。不同于甲型、乙型流感病毒,IDV的潜在N-糖基化位点主要集中分布在HEF基因上。为系统了解不同谱系毒株HEF蛋白的N-糖基化位点和B细胞表位,从Gen Bank数据库获得151条全长HEF基因序列,通过使用MEGA-X生物信息学软件构建遗传进化树,并用在线工具进行各毒株N-糖基化位点和线性B细胞表位预测分析。结果表明IDV的HEF蛋白具有6~8个潜在的N-糖基化位点,其中有2个N-糖基化位点(N146和N613)在不同谱系间相同,有6个N-糖基化位点(N28、N54、N249、N346、N390和N513)在不同谱系间存在差异。B细胞表位在不同谱系间有3个保守的表位和8~9个各谱系独特的表位。线性B细胞表位的预测将有助于设计激活体液反应的多表位疫苗,预测结果还需要体外和体内实验证实来证明该应用的可行性。

维生素D受体基因多态性与RSV感染性毛细支气管炎的相关性研究

目的探讨维生素D受体(VDR)基因多态性与呼吸道合胞病毒(RSV)感染性毛细支气管炎的相关性。方法回顾性分析2023年1~6月佛山市妇幼保健院收治的60例RSV感染性毛细支气管炎患儿的临床资料,根据患儿临床表现分为轻症组(n=37)和重症组(n=23),另选择同期30例RSV阴性的健康体检儿童作为对照组。分别采用酶联免疫吸附法检测三组儿童的血清25-羟基维生素D[25(OH)D]、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素5(IL-5)水平,采用限制性片段长度多态性方法分析维生素D受体TaqI、FokI、ApaI、Bsm I基因多态位点,并比较三组儿童的基因型及等位基因频率情况。结果重症组患儿的血清25(OH)D水平为(52.67±12.22)nmol/L,明显低于轻症组的(65.57±13.54)nmol/L,而轻症组又明显低于对照组的(82.57±15.30)nmol/L,IL-4、IL-5分别为(152.28±22.47)ng/L、(51.83±9.83)ng/L,明显高于轻症组的(130.48±21.35)ng/L、(44.72±8.70)ng/L,而轻症组又明显高于对照组的(77.48±15.26)ng/L、(26.52±7.78)ng/L,差异均有统计学意义(P<0.05);经Hardy-Weinberg平衡定律检测不同组别间VDR基因序列等位基因分布的频率,数据均符合平衡定律(P<0.05);重症组患儿的VDR TaqI(rs731236)基因型TT及等位基因C均高于轻症组和对照组,基因型TC、等位基因T型频率均低于轻症组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),但三组基因型的CC频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05);三组儿童的VDR FokI(rs2228570)基因型频率分布比较差异均无统计学意义(P>0.05),但重症组患儿的等位基因C高于轻症组和对照组,T型频率低于轻症组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);重症组患儿的VDR ApaI(rs7975232)基因型GG及等位基因G高于轻症组和对照组,基因型GT及等位基因A频率分布低于轻症组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05);重症组患儿的VDR Bsm I(rs1544410)基因型GA、AA及等位基因A均高于轻症组和对照组,基因型GG及等位基因G频率分布低于轻症组和对照组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论RSV感染性毛细支气管炎患儿的血清25(OH)D明显较低,VDR TaqI、FokI与患儿发病具有一定相关性,临床上可通过检测患儿VDR基因多态性状况,进一步分析患儿病情严重程度状况,并及时根据遗传体征状况提供针对性的预防和治疗方案。

条件性敲除D1133L基因的重组非洲猪瘟病毒的构建及增殖特性

前期研究初步表明非洲猪瘟病毒(ASFV)编码的D1133L基因对ASFV复制至关重要,本研究拟进一步探究D1133L在ASFV复制中的作用。利用同源重组技术结合大肠杆菌lac阻遏操作系统实现条件性敲除D1133L基因,以pUC118为骨架重组转移载体ASFVΔi130,将重组转移载体转染骨髓源巨噬细胞(BMDMs),以ASFV CN/GS/2018为亲本毒株感染BMDM,在β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)存在的条件下,经绿色荧光和PCR鉴定,获得条件性敲除D1133L重组毒株vD1133Li。利用荧光显微镜观察该重组毒株与亲本毒株在猪肺泡巨噬细胞(PAMs)中的复制差异,利用qPCR技术比较重组病毒与亲本毒株的复制差异,分析vD1133Li在无IPTG情况下回补D1133L蛋白后与在IPTG诱导情况下的复制差异。结果显示:本研究成功构建了条件性敲除D1133L的ASFV重组病毒vD1133Li,重组毒株不表达D1133L,在IPTG诱导下复制能力显著低于亲本毒株;在稳定表达D1133L的MA-104细胞系中,vD1133Li复制能力恢复。综上所述,D1133L基因对于ASFV复制至关重要,试验结果为进一步研究D1133L在ASFV致病中的机制及针对D1133L靶向药物研发提供了研究基础。

塞内卡病毒3D蛋白的截短表达及多克隆抗体的制备

A型塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)是一种能引起猪特发性水疱病(Porcine idiopathic vesicular disease,PIVD)的病原体。SVA 3D蛋白主要编码RNA依赖的RNA聚合酶,与病毒的RNA复制密切相关。为制备3D蛋白的多克隆抗体,试验构建SVA 3D蛋白基因截短片段的原核表达质粒pET-32a-3D,将重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,经诱导表达、纯化获得重组蛋白。用重组蛋白免疫新西兰大白兔后收集血清,获得了SVA 3D蛋白的多克隆抗体。将SVA感染BHK-21细胞,用制备的3D蛋白的抗体进行IFA和Western blot检测,结果显示,用制备的3D蛋白抗体能检测在SVA感染细胞中表达的3D蛋白,说明制备的3D蛋白多克隆抗体与3D蛋白反应性良好,为后续SVA致病机制的深入研究提供材料储备。

猪萨佩罗病毒聚合酶链式反应检测方法的建立及应用

猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus,PSV)是引发猪腹泻的重要病毒之一。为开发一种能快速、准确检测PSV的聚合酶链式反应检测方法,针对PSV的保守区3D基因设计了一对特异性引物,优化了聚合酶链式反应退火温度,分析聚合酶链式反应检测方法特异性和灵敏度,并应用于猪场样品检测。结果表明:建立的聚合酶链式反应检测方法可特异性扩增出PSV目的片段,对其他非靶标猪腹泻病毒则无条带产生,检测低限为5拷贝/μL;在浙江地区采集的88个健康猪粪便样本中检测PSV阳性率为7.95%。该PSV聚合酶链式反应检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于PSV前期诊断和防控。

微RNA-125a-5p和维生素D受体微RNA在乙型肝炎病毒相关性肝癌中的表达及与预后的关系

目的 探讨微RNA-125a-5p(miR-125a-5p)和维生素D受体(VDR)在乙型肝炎病毒(HBV)相关肝细胞癌(肝癌)病人组织中的表达情况及临床意义。方法 选取2014年2月至2016年5月在沧州市第三医院接受手术治疗的HBV相关肝癌病人65例,术中取病人肝癌组织及癌旁组织,比较miR-125a-5p、VDR mRNA在不同肝组织中的表达差异,分析miR-125a-5p、VDR mRNA水平与肝癌病人临床病理特征的关系,采用Pearson法分析miR-125a-5p、VDR mRNA的相关性。随访5年,Kaplan-Meier法分析miR-125a-5p、VDR mRNA水平对肝癌病人生存率的影响。结果 肝癌组织miR-125a-5p水平0.69±0.16低于癌旁组织0.97±0.11(P<0.05),VDR mRNA水平1.73±0.45高于癌旁组织1.03±0.12(P<0.05)。miR-125a-5p、VDR mRNA水平与HBV相关肝癌病人门静脉侵袭、淋巴结转移、分化程度及TNM分期关系密切(P<0.05)。肝癌病人肝癌组织中miR-125a-5p与VDR mRNA呈负相关(r=-0.44,P<0.001)。miR-125a-5p高表达组5年生存率为65.63%,高于miR-125a-5p低表达组的39.39%(P<0.05);VDR mRNA高表达组5年生存率为37.50%,低于VDR mRNA低表达组的66.67%(P<0.05)。miR-125a-5p高表达+VDR mRNA低表达病人、miR-125a-5p低表达+VDR mRNA高表达病人、miR-125a-5p高表达+VDR mRNA高表达病人、miR-125a-5p低表达+VDR mRNA低表达病人5年生存率分别为69.57%、23.81%、63.64%、60.00%,四组比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论 HBV相关肝癌病人肝癌组织中miR-125a-5p表达降低,VDR mRNA水平升高,二者与门静脉侵袭、淋巴结转移、分化程度及TNM分期有关,miR-125a-5p高表达及VDR mRNA低表达病人5年生存率较高,对于预后评估有一定价值。

猪圆环病毒2型灭活疫苗及其亚单位疫苗对PCV2d流行毒株攻毒保护试验

为了评价商品化猪圆环病毒2型(PCV2)全病毒灭活疫苗与PCV2-Cap亚单位疫苗对PCV2d亚型流行毒株的保护情况。选用5周龄PCV2抗原和抗体均为阴性仔猪15头,随机分成3组,每组5头,其中两组分别进行PCV2全病毒灭活疫苗和PCV2-Cap亚单位疫苗免疫,首次免疫1mL,间隔21d以相同剂量和途径重复免疫1mL。二次免疫14d采血分离血清,采用IPMA法检测抗体,PCV2全病毒灭活疫苗于免疫第2周抗体转阳,第5周抗体效价达到均不低于800倍,其中PCV2-Cap重组亚单位病毒样颗粒疫苗免疫组试验猪抗体效价为最高,可达到1:3200。以PCV2d流行毒株进行攻毒,免疫组试验猪的相对增重率显著高于对照组,病理组织学观察显示,免疫组试验猪均未见明显的病理变化,攻毒对照试验猪腹股沟淋巴结出现一定程度的病理损伤。PCV2全病毒灭活疫苗与PCV2-Cap亚单位疫苗均可获得完全保护。

乙肝病毒感染孕妇维生素D营养状况与妊娠结局的关系研究

目的:探讨乙肝病毒感染孕妇维生素D营养状况变化,以及维生素D营养状况对产妇、新生儿妊娠结局的影响。方法:选取2019年8月—2022年10月在首都医科大学附属北京佑安医院产科定期产检及住院生产的150例诊断为患有乙肝感染的孕妇为研究对象,收集同期在本院就诊分娩的98例正常孕妇为对照组。抽取孕妇住院期间清晨空腹静脉血,观察并记录各维生素D营养状况组乙肝感染孕妇妊娠结局,比较对照组和乙肝感染组孕妇血清25(OH)D_(3)水平差异,以及乙肝感染孕妇不同维生素D营养状况组产妇和新生儿妊娠结局的差异。结果:乙肝感染组孕妇血清25(OH)D_(3)水平显著低于正常对照组孕妇[(24.63±2.36)vs(28.84±2.38)ng/mL,P<0.05],且乙肝感染组孕妇维生素D缺乏和不足发生率显著高于对照组[(127/150)vs(49/98),P<0.05]。乙肝感染孕妇中,随着维生素D营养状况的恶化,产妇妊娠期糖尿病、妊娠期高血压,以及新生儿发生早产和新生儿窒息发生率显著增高(P<0.05)。结论:乙肝病毒感染孕妇维生素D营养状况较差,乙肝病毒感染孕妇维生素D不足和缺乏会导致产妇、新生儿不良妊娠结局发生率增高,影响产妇和新生儿预后。

YFV17D非感染性报告复制子及假病毒包装系统的建立

构建YFV17D非感染性复制子及假病毒包装系统,旨在进一步解析黄热病毒的复制、组装分子机制。该研究利用反向遗传学技术,将基于SP6启动子的单拷贝YFV17D报告复制子改造成由CMV启动子驱动的低拷贝YFV17D报告复制子,同时将表达YFV17D结构蛋白的包装质粒与复制子质粒共同转染BHK-21细胞而建立YFV17D的反式假病毒包装系统。通过检测NanoLuc萤光素酶活性(Nluc)、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达、间接免疫荧光实验监测病毒双链RNA来确定复制子在BHK-21细胞中复制情况和包装效果。结果表明,与复制缺陷型复制子相比,野生型复制子转染至BHK-21细胞中,随着转染时间的增加,Nluc活性、oxGFP和mCherry荧光蛋白表达也随之增加,同时dsRNA也随时间延长而增多。将复制子质粒和包装质粒共同转染至BHK-21细胞后,收集上清再次感染BHK-21细胞,随后通过检测Nluc活性和oxGFP与mCherry蛋白的表达而确定假病毒包装成功。综上,成功构建了携带不同报告基因的YFV17D复制子,用于监控病毒基因组RNA的复制;成功搭建由包装质粒提供的结构蛋白,将不具备感染性的YFV17D亚基因复制子打包成具有单轮感染能力的YFV17D假病毒系统。

蛋白激酶D在人类冠状病毒229E复制中的作用及机制研究

目的探究蛋白激酶D(PKD)在人类冠状病毒229E(HCoV-229E)复制中的作用及潜在分子机制。方法以MRC-5细胞作为模型,采用qPCR和Western blot检测PKD家族基因和蛋白的表达水平;通过siRNA敲除Prkd3及PKD抑制剂(CRT0066101)抑制PKD活性,检测HCoV-229E感染细胞后的复制水平;通过CCK8检测细胞活性,TCID_(50)测定病毒滴度,免疫荧光染色检测HCoV-229E的表达和反式高尔基体网络(TGN)的结构;通过检测磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI(4,5)P2)的水平反映磷脂酰肌醇4-激酶IIIβ(PI4KIIIβ)活性;采用PI4KIIIβ抑制剂(BQR695)抑制PI4KIIIβ活性,检测HCoV-229E感染细胞后的TGN的结构变化和HCoV-229E复制水平;采用CRT0066101抑制Vero-E6细胞的PKD活性,检测HCoV-229E感染后的的复制水平。结果PKD家族基因和蛋白表达水平在HCoV-229E感染过程中明显增加,包括Prkd1、Prkd2和Prkd3;与对照组相比,敲低PKD3显著抑制HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=8.999,P<0.001;t=6.920,P<0.001),过表达PKD3则增加了HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=6.630,P<0.001;t=5.794,P<0.001);CRT0066101也显著抑制HCoV-229E的mRNA水平和滴度(t=6.931,P<0.001;t=4.055,P<0.01),免疫荧光染色结果表明,CRT0066101抑制HCoV-229E感染导致的TGN裂变;抑制PI4KIIIβ活性显著降低PI(4,5)P2水平,且BQR695挽救了PKD过表达导致的PI(4,5)P2水平升高(t=6.671,P<0.01),BQR695降低了HCoV-229E感染细胞的TGN裂变,HCoV-229E mRNA水平和滴度(t=5.151,P<0.001;t=7.744,P<0.001);CRT0066101抑制HCoV-229E在Vero-E6细胞中的mRNA水平和滴度(t=7.480,P<0.001;t=7.228,P<0.01)。结论本研究揭示了PKD通过调控PI4KIIIβ影响TGN的裂变参与HCoV-229E复制,并证明PKD抑制剂和PI4KIIIβ抑制剂对降低HCoV-229E的复制具有显著作用,这些发现为今后研究冠状病毒感染的治疗提供重要的参考依据。

猪CD1d蛋白多克隆抗体的制备及应用

[目的]制备猪源CD1d的多克隆抗体,为探究猪CD1d蛋白在非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染过程中的功能奠定基础。[方法]利用PCR方法扩增了猪CD1d基因,并将其同源重组至pGEX-6p1载体中,构建了原核重组表达质粒pGEX-6p1-CD1d。将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)并用IPTG进行诱导表达,表达的GST-CD1d重组蛋白经SDS-PAGE和Western blot(WB)方法鉴定,SDS-PAGE结果显示约50 ku处有一条明显的条带,该蛋白以包涵体形式表达。然后利用谷胱甘肽琼脂糖亲和层析方法进行蛋白纯化,将纯化的GST-CD1d蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后,将纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,采用颈背部多点皮下注射,免疫剂量为200μg/只,首免后第3周和第5周分别进行二免和三免,均采用弗氏不完全佐剂乳化,方法和剂量与首免相同。三免后第7天,通过耳缘静脉采血分离血清。首免后第7周进行第四次免疫,一周后心脏采血。该抗体经Protein G亲和层析纯化后冻存于-80℃冰箱。通过WB和间接免疫荧光(IFA)鉴定瞬时转染表达的外源CD1d蛋白和猪原代巨噬细胞(PAMs)表达的内源CD1d蛋白的表达与细胞定位情况。同样,制备的CD1d抗体可以将外源瞬时转染表达的CD1d通过IP拉下。为了探究CD1d在ASFV感染早期的情况,将ASFV接种于PAMs,制备ASFV感染0、15、30、60 min的样品,以CD1d为一抗,通过WB检测了CD1d蛋白的表达情况。在HEK293T细胞共转pCAGGS-HA-CD1d和pCAGGS-Flag-CD2v质粒,24 h后收取细胞裂解,加入Flag beads过夜结合蛋白,通过WB检测互作情况染,同时,质粒共转染于共聚焦小皿中的HEK293T细胞,用标签抗体对其进行孵育,选择相应的荧光二抗,通过激光共聚焦显微镜观察CD1d与CD2v在细胞中共定位情况。采用Co-IP验证CD1d与ASFV外囊膜蛋白CD2v的相互作用。[结果]原核表达的GST-CD1d蛋白以包涵体形式表达在感受态细胞中,分子质量约为35 ku;实验兔4次免疫CD1d重组蛋白后采血并分离血清,纯化的抗体经SDS-PAGE检测在45和25 ku处各出现一条特异性条带,分别为CD1d抗体的重链与轻链。以纯化的CD1d蛋白作为免疫原制备的兔抗CD1d抗体包含重链和轻链,且具有较好纯度;该抗体能够通过WB和IFA鉴定瞬时转染的外源以及PAMs内源CD1d蛋白的表达和细胞定位。进一步检测结果显示,ASFV感染PAMs后,CD1d蛋白表达水平明显增加,并且WB和IFA结果显示CD1d与ASFV编码的外囊膜蛋白CD2v存在相互作用和共定位。[结论]通过原核表达技术制备了CD1d的抗体,为进一步探究CD1d蛋白在ASFV感染过程中的生物学功能打下了基础。