粘质沙雷氏菌马来酸顺反异构酶表达纯化及酶学性质

从粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)中扩增得到马来酸顺反异构酶基因。将该基因连接到p ET24a载体上,并在Escherichia coli BL21(DE3)中实现了成功表达。酶学性质研究表明,重组酶的比酶活力为48.01 U/mg。其最适温度为37℃,最适p H为8.4。在最适反应条件下,Km值为4.20 mmol/L,Vmax为1.27 mmol/(L·min),kcat为4.38 s-1,催化效率kcat/Km为1.04 L/(mmol·s)。研究结果进一步显示,马来酸顺反异构酶具备良好的热稳定性(55℃半衰期为1.5 h)及高达99%以上的转化率,为马来酸顺反异构酶的进一步研究和工业应用制备高纯度的富马酸提供了理论基础和支持。

顺丁烯二酸异构酶工程菌发酵条件优化

为提高重组大肠杆菌中顺丁烯二酸异构酶表达量,通过正交试验设计,对工程菌的生长条件和目的蛋白可溶表达条件进行优化.采用250 mL三角瓶中装有50 mL(Amp 100 mg L-1)的培养基,分别研究培养基中葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉的浓度,培养基pH值以及摇床转速、装液量、接种量等对蛋白可溶表达量的影响.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌最优化培养基为:蛋白胨20 g L-1、酵母浸粉2.5 g L-1、K2HPO4·3H2O 3.0 g L-1、KH2PO4 1.5 g L-1、NaCl 6 g L-1、MgSO43 g L-1,培养基pH调至6.5.确定顺丁烯二酸异构酶工程菌可溶性表达最优条件为:37℃下培养至D600 nm值为1.0时,添加终浓度为0.05 mmol L-1的IPTG进行诱导,诱导温度37℃,摇床转速220 r min-1,装液量20%,接种量5%,诱导时长为6 h.利用BioFlo 415发酵罐以最优化的培养基和发酵条件对该工程菌进行了3批发酵实验,与摇瓶实验相比,顺丁烯二酸异构酶的表达量提高了近1.5倍,单位发酵液的酶活力由46 U mL-1发酵液提高到78 U mL-1发酵液.以上数据为顺丁烯二酸异构酶重组工程菌的中试发酵奠定了基础.