硫矿硫化叶菌MTSase和MTHase基因的克隆与表达

从嗜热硫矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)ATCC35092的基因组中用PCR方法扩增得到编码MTSase和MTSase的基因,分别将其插入原核表达载体pTrc99a中,并转入大肠杆菌BL21(DE3),进行诱导表达。MTSase和MTHase酶活产率达到了31·3U/g(wetcell)和403U/g(wetcell)。在75℃,pH5·0条件下,两酶联合作用转化淀粉生产海藻糖,当淀粉浓度为15%,DE值为10时,海藻糖转化率最高为53·6%。

重组Athrobacter ramosus S34MTSase和MTHase的酶学性质及其制备海藻糖的应用条件优化

以淀粉为底物,通过麦芽寡糖基海藻糖合成酶(maltosyltrehalose synthase,MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltosyltrehalose hydrolase,MTHase)的共同作用生产海藻糖是一种经济高效的方法。对Arthrobacter ramosus S34来源并分别在E.coli BL21(DE3)中表达的MTSase和MTHase的酶学性质进行研究,发现MTSase的最适温度为45℃,最适pH为7.0,MTHase的最适温度为55℃,最适pH为6.0。随后用2种酶共同作用生产海藻糖,优化反应条件,考查反应温度、初始pH、底物DE值、加酶量以及底物浓度等因素对酶转化过程中海藻糖产率的影响。最佳酶转化条件为反应温度45℃、初始pH5.5,底物DE值8.5,加酶量分别为MTSase最小加量15.75 U/g淀粉,MTHase最小加量7.5 U/g淀粉。

海藻酸钙固定麦芽寡糖基海藻糖水解酶的研究

研究了一种用海藻酸钙包埋麦芽寡糖基海藻糖水解酶(maltooligosyltrehalosetrehalohydrolase,MTHase)的固定化新技术,比较了原酶与固定化酶的最适反应温度、最适反应pH值和热稳定性。结果显示:固定化酶的最适反应温度和稳定温度都由原酶的60℃提高到65℃;固定化酶的最适反应pH值较原酶的5.5降低到5.0。表明MTHase的固定化能有效地提高它的耐热性及耐酸性。这对在未来的海藻糖工业生产中,降低微生物的污染和增加淀粉的溶解度,在更高的反应温度条件下进行海藻糖的合成,提供了一个新思路。

海藻糖合成酶产生菌的筛选及生物合成途径的初步验证

从温泉土壤分离得到11株菌株,它们的胞内释放物能将淀粉转化成海藻糖.对菌株WX-10内含物将淀粉转化为海藻糖的途径进行了初步验证,证明其胞内含有麦芽糖基海藻糖生成酶(MTSase)和麦芽糖基海藻糖水解酶(MTHase).

藤黄微球菌海藻糖生物合成基因的克隆与鉴定

首次从一株能利用淀粉产生海藻糖的藤黄微球菌中克隆了海藻糖生物合成基因。采用PCR方法结合非随机鸟枪法得到藤黄微球菌中低聚麦芽糖苷基海藻糖合成酶(MTSase)基因(MtreY)的全序列及低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶(MTHase)基因(MtreZ)的部分序列,其中MtreY共有2,370个碱基,编码789个氨基酸,表达产物分子量为86·7kD。同源性分析表明,与已报道的MTSase和α-淀粉酶家族成员具有相同的保守模体。将MtreY基因在大肠杆菌JM83中表达,证明表达产物具有预期的酶活性。

TreY-TreZ途径高产海藻糖菌株的筛选

为筛选能以TreY-TreZ途径合成海藻糖的菌株,对采自鲁山中汤温泉水样、温泉土样及面粉厂附近的土样,经高渗平板高温培养,以碘-淀粉水解圈作为初筛方法,通过TLC及HPLC检测,获得了2株产海藻糖的节杆菌属新菌株,经过初步的途径验证,证实这2株菌均以TreY-TreZ途径生成海藻糖。

两种制备海藻糖的生物酶转化工艺技术

海藻糖作为具有特殊生物保护功能的非还原性双糖,被广泛应用在食品、医药等各个领域。以双酶法和单酶法为代表的生物酶转化技术是制备海藻糖的研究热点。双酶法以淀粉为原料,在低聚麦芽糖基海藻糖合成酶和低聚麦芽糖基海藻糖水解酶的协同作用下,将直链淀粉转化成海藻糖。双酶法具有原料便宜易得、工艺较成熟、转化率较高等优点,是最早实现酶法工业化生产海藻糖的方法。单酶法直接利用海藻糖合酶将麦芽糖转化为海藻糖。单酶法因为具有反应过程易控、工艺流程简单、副产物少等优点而受到广泛关注。提高酶的耐高温性能及转化效率是目前2种方法的主要研究方向。随着蛋白基因工程领域的发展,生物酶的优化构建技术日趋成熟,为双酶法的进一步完善和单酶法的工业应用奠定了基础。

麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因在巴斯德酵母中的表达及遗传稳定性

海藻糖是一种具有很多功能的非还原性二糖,在生物制品和食品等行业中具有较广泛的用途.对来自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)B12海藻糖酶转化过程中的关键酶基因--麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)基因进行了遗传密码子的人工改造,合成酵母偏爱密码子和修改基因遗传密码子中的A/T含量,然后将完整的MTHase基因克隆到酵母表达载体pPICZαA,筛选出重组载体并将其导入巴斯德酵母(Pichia pastoris)细胞进行重组表达以用于海藻糖的酶转化.最后获得了一株高效稳定表达MTHase的酵母菌株,分泌到表达培养基上清中的MTHase的酶活大于800U/mg(蛋白质),该重组菌株遗传稳定率达84%以上,为工业化酶法生产海藻糖奠定了一定基础.