哺乳动物的克隆技术——哺乳动物克隆的原理、方法、影响因素及存在的问题

哺乳动物细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术对于优良种畜的复制、减少试验用动物数目、动物遗传多样性保存及濒危动物挽救、转基因动物培育等方面具有重要意义。近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动物相继克隆成功,但也存在克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常的问题。作者阐述了动物克隆的基本原理、操作方法及其相关影响因素,提出了解决相关问题的关键。

人LIF基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的克隆白血病抑制因子(LIF)基因,测定其序列,构建带LIF基因的真核表达载体。方法通过逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法从正常妊娠的子宫蜕膜组织中克隆LIF基因,与T载体连接,再酶切T-LIF载体,获得LIF基因,然后将其与质粒PCDNA3.1(+)连接,构建PCDNA3.1(+)-LIF真核表达载体。结果经酶切和DNA测序证明LIF基因序列正确,载体构建成功。结论成功克隆了LIF基因,构建了PCDNA3.1(+)-LIF真核表达载体,为LIF在相应真核细胞内表达及LIF蛋白的分离纯化奠定了基础。

MAGE-3 DNA疫苗的构建及其免疫效果的观察

通过RT PCR方法扩增MAGE 3cDNA ,以pcDNA3 1+为载体 ,构建重组表达质粒pcDNA3 1 MAGE 3。重组质粒用脂质体转染鼠B16细胞 ,经RT PCR、细胞免疫染色及免疫印迹法鉴定转化细胞中MAGE 3的表达。以 10 0 μg质粒剂量肌肉注射接种小鼠 ,间隔 10天 ,共 3次 ,以空载体和PBS为对照。结果 ,重组质粒免疫的小鼠 ,其脾淋巴细胞对MAGE 3阳性靶细胞的杀伤活性为 51 0 8± 7 41% ,与空载体组 (8 44± 1 89% )及PBS组 (5 76± 1 75% )相比 ,差异有显著性 (P <0 0 1) ,而对MAGE 3阴性靶细胞的杀伤活性分别为 8 2 1± 1 65% ,7 68± 1 56%和 5 13±1 42 % ,其差异无显著性 ;MAGE 3DNA疫苗组免疫血清 1∶15稀释时能检测到抗MAGE 3抗体 ,脾细胞培养上清中Th1类细胞因子IFN γ、IL 2水平明显升高 ,外周血中CD4+、CD8+T细胞也提高 ,小鼠肿瘤的生长速度明显减慢 ,与对照组相比 ,差异显著 (P <0 0 1)。说明MAGE

人载脂蛋白Eε3等位基因的克隆及表达

目的:克隆人载脂蛋白E(Apolipoprotein E,APOE)ε3等位基因,测定序列,并构建带有人源性APOEε3等位基因的真核表达载体。方法:通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从人胎儿脑组织中克隆得到APOEε3等位基因,与PMD19-T载体连接,再酶切PMD19-T-APOEε3,获得APOEε3基因,然后将其与表达载体pEGFP-N1连接,构建pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体。重组质粒转染293T细胞后,在荧光显微镜下观察EGFP的表达,并用Western-Blot的方法检测目的蛋白在293T细胞中的表达。结果:经酶切和DNA测序证明APOEε3基因序列正确,真核表达载体构建成功。将重组质粒转染293T细胞,在转染后的细胞中检测到目的蛋白的表达。结论:成功构建了pEGFP-N1-APOEε3真核表达载体,该表达载体能在真核细胞中正确表达。

哺乳动物克隆的原理与途径

在近年来哺乳动物克隆技术研究的基础上；阐述了克隆的定义及其原理。叙述了作为核供体与受体细胞周期的协调性问题，列出了使供体细胞处于特定细胞周期的一些处理方法。同时也叙述了针对不同时期的供体核对受体卵母细胞采取的不同处理。简述了不同类型的显微操作、去核、电融合及化学激活等方法。提出了哺乳动物克隆所面临的一些重要问题。

影响哺乳动物克隆效率因素研究进展

哺乳动物克隆效率低下,克隆后代发育异常已成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。概述哺乳动物克隆中供体细胞的选择、供体核再编程和重构胚的培养等因素对克隆效率的影响,以及提高克隆效率的策略。

影响动物克隆效率因素的研究进展

哺乳动物克隆效率低下成为目前制约动物克隆技术发展和应用的瓶颈。文章概述了动物克隆中供体细胞的选择、卵母细胞的去核方法、重构胚的激活和重构胚的培养等因素对克隆效率的影响以及提高克隆效率的策略,并对近年来影响动物克隆效率的因素作了详尽的论述,以期为该领域的科研工作者提供参考。

含MGMT及增强荧光蛋白真核表达载体的构建

目的克隆O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因,测序鉴定正确后构建含增强荧光蛋白(EGFP)的真核表达栽体。方法利用RT-PCR从人正常肝细胞中克隆MGMT并与克隆栽体pGEM-T载体相连接。经PCR、酶切及测序鉴定证明克隆成功后用限制性内切酶切下MG- MT片段,同时酶切载体pIRES2-EGFP。凝胶纯化回收后重组构建真核表达载体并鉴定。结果测序结果显示所克隆的编码序列与GeneBank公布MCMT cDNA序列一致。真核表达栽体的PCR及酶切鉴定结果与预期结果一致。结论成功克隆了耐药基因MGMT并构建了含EGFP编码序列的真核表迭载体pIRES2-MGMT-EGFP,为MGMT的进一步相关研究奠定了坚实基础。

哺乳动物克隆技术研究进展

对哺乳动物细胞核移植克隆技术的基本环节作了系统综述，叙述了该研究领域的最新发展。

哺乳动物核移植技术研究进展

随着多种克隆动物的相继诞生,人们越来越关注哺乳动物核移植技术的发展。随着核移植技术的逐步成熟,必将给畜牧业和医学等研究领域带来深远影响。本文综述了哺乳动物核移植技术的研究现状、相关机理及方法的研究,并就存在的问题和应用前景进行了阐述。

提高哺乳动物克隆效率的研究进展

体细胞核移植技术(somatic cell nuclear transfer,SCNT)又称为体细胞克隆技术,在生物医学、遗传修饰动物研究及大家畜的育种和良种扩繁等领域具有重要的理论意义和现实价值,但目前该项技术依然存在如克隆效率低下、克隆动物表型异常等问题。近年来,研究人员通过在培养基中添加小分子药物、选择优势供体细胞系(包括iPS细胞)、优化传统核移植参数、对发育关键基因(如XIST及H3K9me3去甲基化酶等)的靶向遗传调控等途径,探索提高克隆效率的新思路、新工艺和新方法,作者着重对上述研究进展进行简要综述。

Migfilin基因的克隆和真核表达载体的构建

目的克隆Migfilin全长cDNA,构建Flag-migfilin真核表达载体并进行序列测定,为研究migfilin与疾病的关系奠定基础。方法根据人全长migfilin cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板,利用PCR技术克隆migfilin全长cDNA。将扩增出的目的基因克隆至pCR2.1载体,经XbaI/HindIII双酶切后进行重组质粒鉴定,DNA序列测定。将测序正确的目的基因克隆至Flag载体并鉴定。结果成功克隆了migfi-lin全长cDNA,序列测定表明与已知migfilin基因序列一致。在此基础上,构建了Flag-migfilin真核表达载体并进行了鉴定。结论Flag-migfilin真核表达载体构建成功,为深入探讨migfilin在大肠癌中的作用奠定了基础。

哺乳动物体细胞核移植技术研究进展

本文综述了哺乳动物核移植研究的历史、现状、意义及存在问题 。

哺乳动物克隆的研究进展

哺乳动物体细胞克隆是20世纪末生命科学领域最引人注目的高新技术,该技术在农业、生物学和医药等方面具有广泛的应用前景。近年来克隆技术发展迅速,多种哺乳动物相继克隆成功,但也存在着克隆效率太低、克隆动物表型正常而实质异常等问题。本文在近年来克隆技术研究的基础上,对克隆的概念、研究历史以及克隆的方法、过程进行了综述,展望了克隆的意义及克隆动物的应用前景,分析了目前克隆技术尚存在的问题,并提出了解决这些问题的关键。

hOP-1全长基因克隆及真核表达载体的构建

目的 证实人牙乳头细胞中OP 1的表达 ,获得hOP 1全长基因及其高效真核表达载体。方法 提取人牙乳头细胞总RNA ,反转录合成cDNA ,以特异性引物扩增hOP 1全长基因并克隆入T载体 ,筛选阳性克隆进行序列测定后。构建高效真核表达载体pCI OP 1并筛选鉴定。结果 PCR扩增得到一特异性的约 13 0 0bp的片段 ,序列测定结果表明与国外已发表的序列完全一致。构建的pCI OP 1质粒 ,用于基因转染纯度较好。结论 人牙乳头细胞中首次克隆到hOP 1全长基因 。

哺乳动物克隆技术的应用前景与亟待解决的几个问题

哺乳动物克隆技术在组织工程、遗传育种、医药生产、拯救濒危动物等方面均显示出广阔的发展前景.但是目前动物体细胞克隆的成功率只有1%～3%,还很低.解决这一现状的关键问题是要解决细胞质、核周期的相容性,部分个体生理或免疫缺陷,重构胚完成整个发育过程等问题.

盐芥TOR基因的克隆及对盐芥生长发育的影响

雷帕霉素靶蛋白(TOR)在调节动植物的生长及新陈代谢方面起重要作用.为进一步研究植物中TOR的作用,对盐芥TOR基因进行克隆,采用聚合酶链式反应和cDNA末端快速扩增技术等分子生物学方法获得盐芥TOR基因的cDNA全长及基因组全长,构建了ThTOR基因沉默植物表达载体并成功获得盐芥ThTOR基因沉默的转基因株系.结果表明:ThTOR cDNA全长为7836bp,编码2479个氨基酸,蛋白序列与拟南芥同源性高达97.5%,基因组全长19162bp;盐芥ThTOR基因沉默的转基因株系具有生长缓慢、花及种子的发育受阻的明显表型.

哺乳动物胚胎干细胞研究进展

综述了哺乳动物胚胎干细胞的研究历史和进展 ,包括已成功分离出干细胞的动物和材料 ,分离和分化抑制的方法 。

哺乳动物核移植技术研究进展

随着多种克隆动物的相继诞生,人们越来越关注哺乳动物核植技术的发展。逐步成熟的核移植技术,必将给畜牧业和生物学、医学等研究领域带来深远的影响。本文就哺乳动物核植技术的研究简史、现状、相关机理、研究方法,以及存在的问题和应用前景进行了综述。

重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达

目的研究重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的表达。方法用RT-PCR法从人胎肝中克隆出人蛋白C轻重链基因,用PCR突变法获得人活性蛋白C的全基因,将所得全基因连接入哺乳动物细胞表达载体,并转染293细胞研究其表达和活性。结果成功得到重组人活性蛋白C基因,并成功构建哺乳动物细胞表达载体和转染293细胞获高效表达以及相关活性数据。结论通过以上方法可以获得重组人活性蛋白C基因,并实现了在哺乳动物细胞中的高效表达。