转manA基因小鼠F_1代表达效果的检测分析

将携带β-甘露聚糖酶基因manA的转基因FVB原代小鼠与野生型FVB小鼠进行繁殖得到F1代,通过PCR和Southern blot鉴定出F1代转基因小鼠。提取转基因小鼠腮腺、舌下腺、下颌下腺、心脏、肝脏等组织的总RNA,通过RT-PCR检测出manA在转基因小鼠的腮腺和舌下腺组织特异性表达。进行定量PCR验证出manA基因在302号家系小鼠的舌下腺中表达量最高,证明β-甘露聚糖酶基因manA在转基因小鼠的腮腺和舌下腺特异性表达成功。对转基因小鼠唾液进行收集测定β-甘露聚糖酶活性,在302号家系中检测到酶活性较高。通过代谢试验测定饲料中粗蛋白、粗纤维和粗脂肪的消化率,结果显示,与非转基因小鼠相比,302号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗纤维的表观消化率无明显差异,而粗脂肪的消化率得到显著提高;304号家系转基因小鼠对饲料中粗蛋白、粗脂肪、粗纤维消化率方面均无明显差异。

转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠的制备

为了获得β-甘露聚糖酶基因manA的转基因小鼠,从黑曲霉中克隆得到β-甘露聚糖酶基因manA,进行体外表达检测甘露聚糖酶活性后,将此基因插入到含有猪腮腺分泌蛋白(PSP)基因启动子的表达载体pPSPBGPneo中,得到在腮腺组织特异表达β-甘露聚糖酶基因manA的载体pPSP-manA,总长为16.3 kb,将其进行线性化后回收得到高质量DNA片段,通过显微注射得到17只原代小鼠,进行PCR和Southern blot检测发现有6只阳性转基因小鼠,表明转β-甘露聚糖酶基因manA小鼠制备成功。

大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因的克隆与表达

通过PCR克隆了大肠杆菌6-磷酸甘露糖异构酶基因manA,分别构建了含manA基因的原核和真核生物表达载体。在大肠杆菌中经IPTG诱导表达的GST-PMI融合蛋白,经亲和层析纯化和PreScission蛋白酶酶切,SDS-PAGE分析证实PMI蛋白为42 ku。对转manA基因的拟南芥进行PCR分析表明,manA基因已稳定整合到拟南芥基因组中。氯酚红显色反应证实,整合到拟南芥基因组中的manA基因能表达具有6-磷酸甘露糖异构酶活性的PMI蛋白。这些结果说明,克隆的manA基因可在细菌和高等植物中高效表达。