基于转录组测序对翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)2种肌球蛋白重链基因的克隆与分析

肌球蛋白重链(Myosin heavy chain,MYH)是骨骼肌粗肌丝的重要组成单位,其表达量高低影响肌纤维的组成和肌肉生长。为了解其在翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)早期生长过程中的作用,本研究从前期生长差异显著的2组(快长组和慢长组)翘嘴鳜幼鱼转录组差异表达Unigene中筛选出2个MYH基因,RACE(Rapid amplification of c DNA ends)克隆到其全长c DNA(MYH-7a,MYH-7b)。MYH-7a全长为6071 bp,开放阅读框为5820 bp;MYH-7b全长为5896 bp,开放阅读框为5745 bp。序列分析显示,2个MYH均有Loop1、Loop2环、ATP结合位点等关键结构域;进化树聚类分析显示,MYH-7a与MYH-7b均属于慢肌球蛋白。实时荧光定量PCR验证发现,其在快长组样本中表达量显著高于慢长组,与转录组测序结果一致;检测其在翘嘴鳜心肌、红白肌和皮肤等14种组织的表达水平,结果显示,MYH-7a主要在心肌中表达,而MYH-7b主要在红肌中表达;在胚胎发育不同阶段,二者随着胚胎发育的进行,表达量不断增加;在幼鱼早期生长过程(孵化出膜后15 dph、30 dph和60 dph)的翘嘴鳜白肌中,在15 dph和30 dph快长组的表达量显著高于慢长组,而到60 dph时快长组的表达量均显著低于慢长组。翘嘴鳜MYH-7a、MYH-7b在快长组与慢长组鱼中的差异表达提示它们在翘嘴鳜胚胎及其早期生长发育过程中发挥重要作用。

鳜鱼(Siniperca chuatsi)脂肪酸去饱和酶和延长酶基因全长cDNA序列的克隆与分析

利用RT-PCR和RACE方法克隆得到鳜鱼肝脏中控制高不饱和脂肪酸合成的脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase,FAD)和脂肪酸延长酶(fatty acid elongase,ELO)基因的全长cDNA序列。FAD基因的全长cDNA序列1882bp,编码445个氨基酸,该蛋白序列含有FAD全部的特征结构区,包括3个组氨酸簇、2个跨膜区和1个细胞色素b5结构域,与其它鱼类FAD氨基酸序列的同源性为66.5%-90.1%,系统树分析显示其与欧洲鲈鱼和金头鲷等海水鱼类的亲缘关系最近。获得的ELO基因全长cDNA序列1401bp,编码294个氨基酸,该蛋白序列含有单一的氧化还原中心组氨酸簇、内质网停留信号和多个跨膜区等ELO特征结构,与其它几种鱼类ELO氨基酸序列的同源性为71.8%-86.7%,系统进化分析显示其与南方蓝鳍金枪鱼和金头鲷的亲缘关系较近。鳜鱼FAD和ELO基因全长cDNA序列的获得可为进一步研究其HUFA合成能力及调控机理奠定基础。

养殖鳜鱼出血病病原的分离与鉴定

2021年上海市一家鳜鱼养殖场暴发出血病,初始典型症状为下颌出血。本研究通过细菌分离、分子鉴定、生化反应以及健康鳜鱼感染试验等,确认鳜鱼发病死亡由维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)和迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)共同感染所致。分离的维氏气单胞菌鸟氨酸脱羧酶(ODC)和赖氨酸脱羧酶(LDC)反应均为阴性,表明其既不属于维氏气单胞菌维氏生物群(A.veronii biogroup veronii),也不属于维氏气单胞菌温和生物群(A.veronii biogroup sobria),但在遗传上与温和生物群更近;迟缓爱德华氏菌生化反应不产生H2S。分离菌腹腔注射感染健康鳜鱼幼鱼后,被感染幼鱼均出现了死亡现象,且相同数量级病原回感鳜鱼,维氏气单胞菌感染后,鳜鱼发病更快,死亡率更高,感染量为1×10^(7) cfu/尾时即可导致鳜鱼幼鱼在24 h内100%死亡。两种病菌都对硫酸新霉素和红霉素耐药,而对氟苯尼考都高度敏感。本研究为养殖鳜鱼出血病的治疗和控制提供了参考。

翘嘴鳜的人工繁殖与胚胎发育观察

采用不同配伍外源激素对性成熟翘嘴鳜催情,发现:20～24°C下,催产素PG+LRH-A+HCG的效应时间更短;25～29°C下,则催产素PG+HCG效应时间更短。采用人工受精的方法获得受精卵,在水温18～22°C观察翘嘴鳜胚胎发育的时序和特点,从受精卵发育到破膜仔鱼经过了68h17min;翘嘴鳜胚胎发育可分为7个阶段26个时期。文章还详细记录了翘嘴鳜胚胎发育各个阶段的形态特征。

鳜鱼头肾的组织发生及成鱼头肾B淋巴细胞的分布

通过整体连续切片,研究了鳜鱼不同发育时期的头肾结构,并利用原位PCR方法检测了B淋巴细胞在鳜鱼头肾中的分布。在孵化后第1d观察到了肾组织,主要由肾小管组成。尔后头肾的发育经历了三个结构和功能的转变。第一个阶段为孵化后第1d到第7d,头肾作为滤过性器官存在,由肾小管及少量淋巴细胞组成。第二个阶段从第8d到第36d,是一个功能混合型阶段,头肾中既有肾小管,又有造血组织;随时间推移,肾小管数量减少,淋巴细胞数量剧增。紧接着进入第三个阶段:肾小管完全消失,头肾中开始出现大量的嗜铬细胞,头肾作为淋巴-肾上腺组织而存在。肾上腺首先出现在头肾前端,随发育成熟,集中分布于头肾门静脉周围。IgM在鳜头肾中大量表达,IgM分泌细胞分布于整个头肾组织,在血管周围有集中趋势[动物学报51(3):440-446,2005]。

3种免疫途径对嗜水气单胞菌灭活疫苗保护作用的影响

应用间接ELISA方法,研究经嗜水气单胞菌疫苗浸泡、口服、注射免疫后鳜皮肤、肠道黏液和血清中抗体的变化关系,揭示鳜对3种免疫途径的免疫应答效果。结果显示:黏液抗体产生快(7 d达到峰值),但持续时间短,抗体水平低(213);血清抗体产生慢(28 d方达峰值),但持续时间长,抗体水平高(225)。不同方式免疫鳜后均产生远高于对照组的抗体滴度(P<0.05)。注射组产生的抗体水平高(225),免疫保护率最理想(70.6%);口服组相对另两个实验组,其抗体峰值(215)和免疫保护率(41.2%)均较低;浸泡组在皮肤黏液产生水平和溶菌酶含量方面,产生较好的免疫效应,分别为213和178μg/mL,但相对保护率仅为47.1%,低于注射组的70.6%。浸泡和口服组可诱发局部黏膜免疫,在抗体动态变化方面表现出相似的规律且峰值时间早于注射组。初步推断浸泡和口服可以直接刺激鱼体黏膜组织产生局部的特异性抗体。

摄食水平对翘嘴鳜幼鱼体组成、生长、排粪、排泄及氮收支的影响

利用生物能量学的方法研究翘嘴鳜[Siniperca chuatsi(Basilewsky)]幼鱼(初始体质量2.52～3.79 g,平均体质量3.11 g)在不同摄食水平(饥饿、1%、2%、3%、4%、饱食)下的体组成、生长、排泄、排粪及氮收支,建立生长、氮排泄、排粪与摄食水平的回归方程。试验水温为26.5～28.0℃,平均水温27.3℃。试验结果表明,随着摄食水平的增加,鱼体干物质、蛋白质、脂肪含量呈增加趋势,灰分含量呈降低趋势。随着摄食水平的增加,食物转化效率呈增大趋势,吸收效率略微增加,特定生长率呈线性增长趋势。排泄氮(UN)、粪便氮(FN)随着摄食水平增加显著增加,排泄氮、粪便氮与摄食水平(LR)的关系可分别用回归方程描述为:UN=0.449 6LR+0.097 9,FN=0.078 1LR+0.019 2。随着摄食水平的增加,用于生长的氮所占比例呈增大趋势,排泄氮和粪便氮比例呈减少趋势,饱食时的氮收支方程为:100CN=45.20GN+7.46FN+47.34UN。

鳜胃蛋白酶原A、胃质子泵基因cDNA全长的克隆与细胞表达定位

利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术获得了鳜全长1 322 bp的胃蛋白酶原(pepsinogen,PG)A2 cDNA序列,含1 131 bp的开放阅读框(ORF),共编码376个氨基酸,氨基酸序列包含信号肽、激活肽和胃蛋白酶3部分,胃蛋白酶部分含有2个天冬氨酸活性位点和3个二硫键。鳜胃蛋白酶A2与A1在序列组成、理化性质、功能位点、空间结构上存在明显差异,表明它们可能具有不同的催化功能。胃质子泵(gastric H+/K+-ATPase)是胃酸分泌的关键性酶,研究克隆获得了鳜全长3 581 bp和1 669 bp的胃质子泵α、β亚基cDNA序列。序列相似性分析显示,胃质子泵α亚基具有高度保守性,含多个功能位点,而β亚基具有相对可变性。原位杂交(in situ hybridization,ISH)结果显示,鳜PG A1、PG A2和胃质子泵α亚基mRNA均在胃腺的同一类型细胞中表达,该细胞兼有分泌PG和胃酸的功能,鳜胃腺分泌细胞属于泌酸胃酶细胞。

两种鳜病毒的共感染现象及引起感染细胞的超微变化

借助细胞培养和电镜技术,揭示了鳜球形病毒(Siniperca chuatsi spherical virus,SCSV)与鳜弹状病毒(Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV)在草鱼鳍细胞(Grass carp fins,GCF)中共感染的现象。在筛选到敏感鱼类细胞系和建立了 鳜病毒体外增殖系统的基础上,取息典型病毒感染出血症的鳜组织,制备组织悬液,接种到GCF细胞中传代培养, 在攻毒后间隔不同时间收集细胞,对攻毒细胞的超薄切片进行电镜观察。揭示两种形态的鳜病毒可在同一个GCF 细胞中增殖,并描述和分析了病毒复制引起感染细胞的超微病变。本研究结果有助于阐明鱼类重要病毒病害的发 生过程及致病机理。

巢式PCR检测鳜传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)

鳜(Siniperca chuatsi)传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)是鳜暴发性传染病的主要病原,给鳜养殖业造成了严重的经济损失,因此快速、灵敏的检测方法对鳜养殖业的发展具有非常重要的意义。根据鳜ISKNV主要衣壳蛋白(MCP)基因序列设计了2对引物,利用巢式PCR方法对病鱼脾肾组织进行扩增,建立了ISKNV快速特异的巢式PCR检测方法。应用该方法对含MCP基因的质粒进行倍比稀释后检测扩增的灵敏度可达到5fg;巢式PCR检测的灵敏度是一步法PCR的104倍以上。

鳜鱼血清总胆固醇含量与性别关系研究

用硫磷铁法测定了不同性别的26尾鳜鱼血清总胆固醇含量,结果表明,13尾雌性鳜鱼总胆固醇的平均含量为754.7mg/100mL,13尾雄性鳜鱼总胆固醇的平均含量为988.2mg/100mL。t检验表明,雄性鳜鱼血清总胆固醇含量显著高于雌性鳜鱼。

翘嘴鳜UCP3基因cDNA的克隆及其胚胎发育表达分析

本研究采用RT-PCR、3′-RACE和5′-RACE技术,从翘嘴鳜胚胎组织中克隆得到UCP3基因的全长cDNA序列(登录号:KP244309)为2 917bp。生物信息学分析表明:翘嘴鳜UCP3基因编码区为930bp,总共编码309个氨基酸;带负电荷的氨基酸残基数22个,带正电荷的氨基酸残基数35个。翘嘴鳜UCP3发育表达分析表明,UCP3在受精期、二细胞期、囊胚期、肌效期、心搏期、仔鱼期有低量表达,从囊胚期到神经胚期显著性增高并达最大值,神经胚期到肌效期显著性降低,肌效期、心搏期、仔鱼期都保持在低水平表达。

翘嘴鳜USP7基因cDNA的克隆及饥饿对其表达影响分析

为探讨饥饿对翘嘴鳜肝脏USP7基因表达的影响,本文应用实时荧光定量PCR、3′-RACE和5′-RACE技术,从翘嘴鳜肝脏组织中克隆得到了USP7基因的全长cDNA序列(登录号:MF000683)为4 319bp。生物信息学分析表明:翘嘴鳜USP7基因编码区全长为3 336bp,共编码个1 111氨基酸,其中180个带负电荷,137个带正电荷。翘嘴鳜USP7在饥饿中的表达分析表明,肝脏USP7基因在不同饥饿时间的相对表达量呈现一个峰值变化,在饥饿4d时出现显著的上升且到达最高值;在饥饿7d时又逐渐下降,最终达到初始水平(P<0.05)。本文结果发现饥饿后肝脏中USP7表达量的变化可能与翘嘴鳜的生长和健康状况密切相关,为鳜鱼的生产养殖提供一定的理论依据。

鳜胸腺组织学结构及抗体分泌细胞的免疫组织化学

使用常规组织学和免疫组织化学方法对鳜胸腺进行研究。观察到鳜胸腺位于鳃盖与背的联合处,呈三角形,对称分布;胸腺实质随年龄增长分叶逐渐明显,大体可分三个区,外区、中区和内区,中区和内区分别相当于哺乳动物的皮质区和髓质区。外区主要由扁平上皮细胞和粘液细胞组成,中区可观察到大量网状纤维和淋巴细胞,内区主要由排列较疏松的淋巴细胞组成。此外,光镜下还观察到哈氏小体和髓质上皮囊的存在。免疫组织化学结果显示胸腺中抗体分泌细胞主要分布在外区和中区,胸腺分叶部位尤为明显。阳性细胞胞膜着色明显,呈清晰棕黄色。

鳜鱼遗传多样性的RAPD指纹分析

采用20个随机引物对三个不同水域(秋浦河、长江、万佛湖)的鳜鱼群体的基因组进行了RAPD检测。得到了群体内、群体间的遗传相似性系数及遗传距离,为鳜鱼的遗传多样性研究及地方品种的选育提供了重要的资料。

鳜鱼血清总脂含量与性别关系的研究

用香草醛法测定了30尾不同性别鳜鱼血清总脂含量,结果表明,17尾雄性鳜鱼平均总脂含量为728.2mg·100mL-1,13尾雌性鳜鱼平均总脂含量为1 047.6 mg·100mL-1;t=2.805 4>t0.01(28)=2.763 3,表明雌性鳜鱼血清总脂含量显著高于雄性鳜鱼。

利用AFLP技术检测外源总DNA导入鲫的研究

本研究以鳜Siniperca chuatsi基因组DNA为外源供体基因,以鲫Carassius auratus为受体,采用显微注射法将外源鳜基因组DNA直接导入鲫受精卵中,获得转基因鲫,以了解外源总DNA直接导入鲫方法的可行性。利用AFLP分子标记技术检测了显微介导鳜基因鲫,结果在15对AFLP引物中发现两对AFLP引物在显微介导鳜基因鲫中扩增出和外源鳜基因相同而对照鲫没有的带型。为进一步找到精确的遗传学证据,对5尾阳性显微介导鳜基因鲫的扩增产物进行回收、克隆和测序。结果表明,阳性显微介导鳜基因鲫中均含有供体基因目的片段,在基因水平上证明鳜基因组DNA可通过显微注射方式整合到鲫基因组中,为开发鲫新种质技术提供理论基础。

广东与湖南养殖鳜群体随机扩增多态DNA研究

采用RAPD技术对广东和湖南养殖鳜群体进行了遗传多样性分析。从40个随机引物中筛选出22个有效引物,共扩增产生289条RAPD标记片段,广东养殖群体共产生155条扩增片段,湖南养殖群体共产生134条扩增片段,有122条带为两群体共有。广东和湖南养殖群体内平均遗传距离分别为0.063 3和0.062 9,两群体间遗传距离为0.129 9。广东和湖南养殖群体Shannon多样性值分别为0.069 0和0.072 3,多态座位比例分别为25.16%和10.15%。与脊椎动物平均多态座位比例比较,发现其遗传多样性并不很丰富。因此,需要在生产过程中要采取行之有效的管理措施以避免或减少遗传多样性水平的降低,确保鳜养殖业的可持续发展。

鳜T细胞表面受体CD4分子的克隆与表达分析

克隆了鳜T细胞表面受体CD4分子的cDNA序列并对其在组织/器官的表达进行了分析。鳜CD4分子的cDNA序列全长为2 356 bp,编码469个氨基酸。该CD4分子由4个免疫球蛋白样结构域(V1-C1-V2-C2)构成的胞外区、一个跨膜区和一个包含保守的CXC基序的胞内区组成。系统进化分析表明,鳜CD4分子与同属于鲈形目的鲈CD4分子聚为一支,与鲈的相似性最高(57%),与鲤的相似性较低(34%)。序列比对分析显示,CD4分子胞外区存在多个保守性位点,如:C1结构域中的WTC基序、V2和C2结构域中的N-糖基化位点等。同鸟类和哺乳类不同的是,鳜CD4分子在V1结构域中缺少由半胱氨酸(Cys)残基对形成的二硫键,而在V2结构域中存在一个额外的二硫键,这可能会改变CD4分子的空间构象,进而影响到CD4与MHCⅡ的结合以及后续的抗原诱导的T细胞活化等。荧光定量PCR分析表明,CD4mRNA在鳜的胸腺中表达量最高,在脾脏中表达量最低。脂多糖腹腔注射8 h后,CD4 mRNA在鳜的胸腺、脾脏和头肾中都呈显著的上调表达(P<0.05)。