羊源溶血性曼氏杆菌SYS-1株分离鉴定及其毒力与耐药性分析

绵羊上呼吸道疾病是兽医临床常见病,常见病因为溶血性曼氏杆菌感染。该菌具有多种血清型且呈区域性流行,造成当地绵羊养殖业严重经济损失。为探究陕西榆林羊场呼吸道疾病发病原因和危害,丰富该病防治措施,试验采集羊场有呼吸道病史的病死羊肺组织进行平板划线,对其分离的菌株进行形态学观察、生化试验及分子生物学鉴定及药敏性和小鼠致病性试验。结果表明,该菌株为A1型溶血性曼氏杆菌SYS-1株,含有毒力因子抗白细胞毒素,具有致死性风险。分离菌可发酵甘露醇和山梨醇,无法发酵甘露糖。吲哚试验结果阴性,过氧化氢试验呈阳性。该菌株生长缓慢,可对恩诺沙星、氟苯尼考等药物敏感,对庆大霉素和红霉素耐药。

新疆部分地区规模化羊场羔羊多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、绵羊肺炎支原体的调查与分析

为了阐明新疆昌吉、石河子、阿勒泰、塔城及喀什5个地区规模化羊场多杀性巴氏杆菌(Pm)、溶血性曼氏杆菌(Mh)、绵羊肺炎支原体(Mo)的流行情况,试验采集以上5个地区290份6月龄内羔羊鼻拭子样本,提取DNA后采用PCR方法检测Pm、Mh、Mo特异性基因,统计Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率、单阳性率、双重阳性率和三重阳性率,对3种病原核酸个体总阳性率进行Spearman相关性分析,并分别统计3种病原在不同月龄、不同地区羔羊中的流行情况,采用卡方检验分别对有呼吸道症状和无呼吸道症状羔羊3种病原核酸的单阳性率、双重阳性率和三重阳性率进行差异显著性分析。结果表明:在290份鼻拭子样本中,Pm、Mh、Mo的核酸个体总阳性率分别为6.21%(18/290)、67.24%(195/290)、61.03%(177/290),核酸单阳性率分别为0(0/290)、14.48%(42/290)、8.97%(26/290);Pm-Mh、Pm-Mo、Mh-Mo核酸双重阳性率分别为0.68%(2/290)、0(0/290)和46.55%(135/290),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率为5.51%(16/290)。Pm与Mh的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01),Pm与Mo的核酸个体总阳性率呈显著正相关(P<0.05),Mh与Mo的核酸个体总阳性率呈极显著正相关(P<0.01)。Pm主要在4月龄羔羊中流行,而Mh和Mo在各月龄羔羊中均普遍流行;Pm主要在石河子市和昌吉市流行,Mh和Mo在各地区均普遍流行。有呼吸道症状的羔羊Pm、Mh核酸单阳性率及Pm-Mo、Pm-Mh核酸双重阳性率与无呼吸道症状的羔羊均差异不显著(P>0.05);有呼吸道症状的羔羊Mh-Mo核酸双重阳性率极显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01),Pm-Mh-Mo核酸三重阳性率显著高于无呼吸道症状的羔羊(P<0.05),Mo核酸单阳性率极显著低于无呼吸道症状的羔羊(P<0.01)。说明新疆地区羊群存在Pm感染,Mh和Mo呈普遍流行趋势,因此应加强对易感羊群的病原学检测,做好新疆地区羊呼吸道疾病的防控工作。

羊溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌双重PCR鉴别检测方法的建立与应用

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)和多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是两种条件性致病菌,可导致多种临床症状,给羊产业造成一定经济损失。为临床上快速、准确地鉴别诊断这两种细菌所导致的疾病,根据Mh的Lkt基因和Pm的kmt基因分别设计引物,建立了在一个反应体系中同时鉴别检测这2种细菌的PCR方法。结果显示:建立的PCR鉴别检测方法对Mh、Pm基因组DNA的检测限分别为7.23×10^(-6)、6.99×10^(-5) ng/μL,对羊链球菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、羊支原体核酸检测均为阴性,在多次重复试验中均可检测出阳性样品,其反应试剂均扩增出预期大小的片段。对95份羊源疑似临床样品进行检测,Mh检出率为38.95%(37/95),Pm检出率为53.68%(51/95),混合感染检出率为12.63%(12/95),鉴别检测结果与单重PCR检测结果基本一致。结果表明:该方法具有较好的特异性、敏感性、重复性及稳定性,可用于临床检测,为羊呼吸道疾病的鉴别诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测手段,具有良好的临床应用前景。

绵羊源溶血性曼氏杆菌A2型的分离鉴定及耐药性分析

【目的】新疆某羊场的羊出现精神沉郁、咳嗽气喘、消瘦等症状,为确定此次发病病原。【方法】该羊场共送检4份病羊肺脏,从肺脏中分离培养了一株细菌并对其进行培养特性观察、PCR鉴定、血清型鉴定、药敏试验和动物致病性试验。【结果】结果显示分离出的一株革兰氏阴性菌,其形状及大小疑似溶血性曼氏杆菌;PCR鉴定结果显示为溶血性曼氏杆菌,分离菌株血清型为A2型。该分离菌株对青霉素、头孢唑林、氨苄西林等敏感;在致病性试验中,小鼠在15 h内陆续死亡,说明该菌株具有一定致病力。【结论】该病例致病原为A2型溶血性曼氏杆菌,对青霉素、头孢唑林、氨苄西林等敏感。

犊牛支原体混合感染巴氏杆菌、曼氏杆菌的诊断与防控

新疆某规模化奶牛场犊牛呈现严重的呼吸道综合症,治疗后无果出现死亡,为查明发病原因,采用现场调查结合实验室PCR方法对病死牛病料进行确诊。结果表明,发病犊牛出现咳喘、呼吸急促、流黏脓性分泌物;剖检后观察到肺脏出现严重出血、充血、实变、纤维素性渗出,且胸腔积液;经牛支原体、巴氏杆菌、曼氏杆菌的特异性引物进行PCR检测可扩增出相应大小目的条带。针对检测结果,建议牧场通过改善环境、加强饲喂、免疫防控,采用中西医药物防治相结合的方式进行防控,取得了较好的防控效果。

新疆牛源溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性和毒力分析

为鉴定新疆石河子地区某规模化牛场表现呼吸道感染症状荷斯坦病牛的细菌性病原及其分离株的血清型、耐药基因和毒力基因携带情况,本研究无菌采集病死牛病变组织,采用常规细菌分离培养及PCR方法鉴定细菌,采用PCR方法检测其血清型、耐药基因和毒力基因携带情况,采用K-B纸片法检测其耐药表型。结果显示,从病变组织样品中分离了4株荚膜A1型的溶血性曼氏杆菌(Mh-1、Mh-2、Mh-3、Mh-4);耐药表型显示4株Mh对β-内酰胺类(青霉素)、氨基糖苷类(链霉素)和糖肽类(替考拉宁)药物耐药;耐药基因仅检测到β-内酰胺类基因blaTEM;分离菌株Mh-1携带8类9种毒力基因中的5种(LKT-C、gs60、fbpA、gapA、ptfA),Mh-2携带其中的4种(LKT-C、plpB、dnaN、ptfA),Mh-3携带其中的7种(LKT-C、plpB、gs60、fbpA、gapA、dnaN、ptfA),Mh-4携带其中的6种(LKT-C、plpB、gs60、fbpA、gapA、ptfA)。同时分离出1株荚膜A型,脂多糖L3型的多杀性巴氏杆菌(Pm-1);Pm-1仅对克林霉素耐药;Pm-1携带6类12种不同的毒力基因(exbD、tonB、hsf2、ptfA、oma87、ompA、ompH、plpB、psl、nanB、tbpA、pmHAS)。将Mh和Pm-1均以3.2×10^(8) cfu/mL的剂量感染30只小鼠进行致病性试验,结果显示,4株Mh感染小鼠于3 d内陆续全部死亡,Pm-1感染小鼠于10 h内全部死亡,表明分离菌株Mh和Pm-1均携带致病性毒力基因,且具有较强的致病性。结果表明,新疆石河子地区某集约化牛场表现为呼吸道症状病死牛的细菌性病原是牛源Mh和Pm混合感染,两者均携带与呼吸道粘附侵染相关的IV型菌毛基因ptfA,且Pm-1株主要对青、链霉素耐药,对大多数药物较敏感,为本地区牛呼吸道疾病综合征的流行病学调查与临床治疗提供参考依据。

牛溶血性曼氏杆菌对BT细胞炎症因子及其TLR4/NF-κB信号通路影响的研究

为探究牛溶血性曼氏杆菌(Mh)感染新生牛鼻甲(BT)细胞是否发生炎症反应及其涉及的信号通路,本研究将不同浓度的Mh分别感染BT细胞后经MTT法检测Mh对BT细胞的毒性作用,确定合适的感染浓度。结果显示,与空白对照细胞相比,以终浓度1×10^(4)cfu/mL、1×105cfu/mL的Mh感染后BT细胞的存活率均在80%以上;以浓度1×10^(6)cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在60%~70%,以终浓度1×10^(7)cfu/mL的Mh感染BT细胞后的细胞存活率在50%以下;因此确定终浓度1×10^(6)cfu/mL为Mh的最适感染浓度。将Mh以终浓度1×10^(6)cfu/mL感染BT细胞后,采用荧光定量PCR(qPCR)检测细胞中细胞因子(IL-1β、IL-6及TNF-α)m RNA的转录水平;采用间接ELISA检测细胞上清中上述各细胞因子的分泌水平;通过western blot检测BT细胞中TLR4/NF-κB通路中Toll样受体4(TLR4)、p-P65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)的表达水平。q PCR和间接ELISA结果显示,Mh感染的BT细胞中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-αm RNA转录水平及蛋白分泌水平均极显著高于空白对照细胞(P<0.001)。Western blot结果显示,与空白对照组相比,Mh感染的BT细胞中TLR4、p-P65蛋白的表达水平显著升高(P<0.05),p-IκBα蛋白的表达水平极显著降低(P<0.01)。本研究首次表明,Mh感染诱导BT细胞发生了炎症反应,并且该炎症反应是通过激活TLR4/NF-κB信号通路及其相关蛋白的表达实现的。本研究为Mh发病机制的研究及其所致疾病的防治提供参考依据。

牛溶血性曼氏杆菌可视化LAMP检测方法的建立

为建立一种能够快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)的可视化LAMP检测法,利用LAMP引物设计软件,以溶血性曼氏杆菌保守基因lktC序列设计内引物、外引物及环引物,对其反应温度、Mg^(2+)浓度、dNTPs浓度等条件进行优化,并检测了方法的敏感性、特异性及实用性。结果显示,该方法在68.2℃、6 mmol/L Mg^(2+)、1.6 mmol/L dNTPs条件下达到最佳,40 min内完成检测并可通过肉眼判定结果,对细菌的最低检测限为6.7×10^(-1)cfu/μL,对lktC重组质粒的最低检测限为7.9×10^(2)copies/μL,敏感性高;与15种病原均不发生交叉反应,特异性好;对背景清晰小鼠肺组织样本检测结果显示该方法实用性良好,且优于普通PCR方法。表明该方法可快速、高效检测牛溶血性曼氏杆菌。

牛呼吸疾病综合征七病原联合检测多重qPCR方法的建立

为了提高牛呼吸疾病综合征多病原混合感染的临床诊断效率,以牛支原体(Mycoplasma bovis,M.b)oppD/F基因、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,P.m)ompH基因、溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,M.h)gcp基因、牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因、牛呼吸道合胞体病毒(bovine respiratory syncytial virus,BRSV)以及牛副流感病毒(bovine parainfluenza virus type,BPIV) 3型a和c基因型(BPIV-3a,-3c)的N基因等为检测靶标,分别设计特异性引物和Taqman探针,通过优化反应条件,采用3管7联的组合方式建立了7种病原体的多联实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,该方法仅对本试验的7种病原有特异性反应,与其他常见病原无交叉反应。对M.b、P.m、M.h、IBRV、BRSV、BPIV-3a和BPIV-3c质粒标准品的最低检测限分别为102、102、101、102、102、102和101拷贝/μL。组内变异系数小于2.5%,组间变异系数小于5.5%。平行应用该方法和常规PCR方法对临床采集的115份有呼吸道症状牛的鼻拭子进行检测,P.m阳性率36.65%,M.b阳性率27.83%,M.h阳性率25.22%,IBRV阳性率11.30%,BPIV-3c阳性率8.57%,BRSV阳性率0.95%;其中混合感染率为26.1%。共检测到11种混合感染模式,主要由M.b与其他病原体的混合感染,占72.7%(8/11);M.b/P.m混合感染的检出率最高,占60%(18/30);M.b、P.m、M.h在混合感染中出现率排前三,其占比分别为73.3%(22/30)、73.3%(22/30)和43.3%(13/30);其次为IBRV,占26.7%(8/30);BPIV-3c占13.3%(4/30)。以上结果表明,该方法具有较高的分析敏感性和特异性,可用于牛呼吸疾病综合征多病原感染的联合检测。

一例牛支原体与溶血性曼氏杆菌混合感染的诊断与治疗

为了探明引起甘肃省张掖市某养殖场牛只死亡的病原,试验通过临床检查及剖检观察对发病牛只进行初步诊断;然后无菌采集病死牛只的鼻拭子及肺脏组织样品,采用TaqMan探针实时荧光定量PCR方法对3种牛呼吸道疾病的重要病原(牛支原体、溶血性曼氏杆菌及多杀性巴氏杆菌)进行快速检测,并根据诊断结果对有疑似症状及明显症状的牛只进行对症治疗。结果表明:牛只发病时主要表现为精神不振、干嗽气喘、鼻腔流出气泡状黏液等症状,从症状明显到死亡的时间为6~8 h。剖检可见肺脏出现“大理石”样病变,肠系膜淋巴结肿大。所检的10份鼻拭子样品中有6份为牛支原体核酸阳性,4份为溶血性曼氏杆菌核酸阳性;所检的10份肺脏组织样品中有6份为牛支原体核酸阳性,2份为溶血性曼氏杆菌核酸阳性;所有鼻拭子及肺脏组织样品中多杀性巴氏杆菌核酸均为阴性。将发病牛只进行隔离转移后,使用加米霉素注射液、硫酸头孢喹肟等抗生素结合“板黄口服液”等中药制剂进行治疗,并将养殖场外环境及圈舍进行彻底消杀,随后大部分发病牛只逐渐恢复健康,养殖场恢复正常运行。说明该养殖场发病牛只感染了牛支原体与溶血性曼氏杆菌,采取隔离治疗、彻底消杀等综合措施后,取得了较好的效果。

牛源溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其生物学特性分析

旨在分离鉴定牛场具有呼吸道症状奶牛的溶血性曼氏杆菌病原及其分离株的血清型、耐药基因和毒力基因携带情况。本研究对531份呼吸道症状奶牛鼻拭子进行细菌分离纯化,将疑似菌株进行lktC基因鉴定,同时进行血清型鉴定和16S rRNA测序分析,利用10种抗生素进行耐药性试验,并选择11种毒力基因研究溶血性曼氏杆菌毒力基因的携带情况,利用小鼠攻毒试验确定其致病性。结果显示:共分离出16株溶血性曼氏杆菌,血清型鉴定为A2型2株、A6型4株,A1型7株,未定型3株;药敏试验发现,分离株均对氨苄西林和红霉素耐药;毒力基因鉴定显示16株溶血性杆菌中14株均携带11种毒力因子;致病性试验发现,菌株2114F8、2020Y1和2010Q5接种后小鼠后,小鼠于36 h内陆续死亡,从死亡小鼠肺中检测到溶血性曼氏杆菌。本研究结果为溶血性曼氏杆菌引起的牛呼吸道疾病综合征的防控提供了理论依据。

猪溶血性曼氏杆菌的分离与鉴定

从湖北省出现肺炎的某猪场育肥猪中分离出一株革兰氏阴性杆菌,经病原分离、革兰氏染色、PCR鉴定、生化鉴定,确定其为溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)。该菌呈革兰氏阴性的短小杆菌,两极着色。通用引物扩增片段基因序列比对结果显示,该菌基因序列与溶血性曼氏杆菌同源率在99.7%以上,其生化特性符合溶血性曼氏杆菌生化特性。该菌2×10^8CFU/mL可致死小白鼠,具有较强的致病力。药敏试验结果显示,该菌株对氨苄西林、头孢噻肟和环丙沙星等大多数抗菌药物敏感。

溶血性曼氏杆菌致病机制的研究进展

曼氏杆菌病是牛、羊等反刍动物的重要呼吸道传染病,给养牛和养羊业带来较大的经济损失,溶血性曼氏杆菌是该病的病原,作者对其生物学特性、临床症状、毒力因子、致病机制等进行简要概述,为进一步深入研究提供参考。

绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

为了对引起绵羊肺炎的病原进行分离、鉴定和耐药性分析,本研究通过无菌采集绵羊肺脏并对细菌进行分离纯化、生化试验和PCR鉴定,然后对所得到的溶血性曼氏杆菌分离株进行药物敏感性研究。结果显示,分离纯化得到的细菌为革兰氏阴性短杆菌,具有弱溶血性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;耐药性分析显示该菌株对恩诺沙星、庆大霉素、四环素等大部分药物敏感。本研究为绵羊溶血性曼氏杆菌感染的有效防制提供有用的信息和数据。

溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研制及初步应用

在溶血性曼氏杆菌PCR检测方法研究的基础上,进行溶血性曼氏杆菌PCR检测试剂盒的研究及初步应用。结果表明,试剂盒特异性好,批内和批间的试剂盒无差异;试剂盒在-20℃可保存30个月,4℃可保存12个月;应用试剂盒从1 000多份临床样品中筛选分离到6株溶血性曼氏杆菌。

致肉牛运输热溶血曼氏杆菌的分离鉴定及部分生物学特性研究

为探明一起肉牛运输热的病原及生物学特性,本研究无菌采集病死牛心血、肺脏、肝脏和脾脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究。结果显示,7株分离菌均为革兰氏阴性短杆菌,具有微弱的β-溶血,瑞氏染色可见两极浓染及明显的荚膜。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶、MR-VP和吲哚,产生少量酸而不产气,结果符合溶血曼氏杆菌生化特性。PCR鉴定均为荚膜血清A2型,分离菌均含有四型菌毛相关基因ptfA、参与复制相关基因dnaN、白细胞介素相关基因LktC3种毒力基因。分离菌对小鼠的LD50值在107.83～108.50 CFU/mL之间,不同菌株间小鼠LD50值存在一定差异,但差异不明显。结果表明,引起该批肉牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A2型溶血曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血曼氏杆菌的致病机制提供参考。

溶血性曼氏杆菌PCR检测方法的研究

溶血性曼氏杆菌是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌。为快速、准确诊断由本菌导致的疾病 ,从基因库中获得溶血性曼氏杆菌( M.haemolytica )的基因序列 ,再从其基因序列中获得与其它细菌包括 M.annheimiagranulomatis,M.varigena ,M.ruminalis,M.glucosidal ,M.annheimiaspp和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段 ,设计成引物 ,建立了特异性好、敏感性高的 M.haemolytica PCR检测方法。结果表明 ,除溶血性曼氏杆菌为阳性外 ,其余所有细菌均为阴性 ,特异性为 1 0 0 % ,最小检出量为 8× 1 0 2 cfu/ m L 曼氏杆菌或 1 / 1 0个单个菌落。检验人工感染牛 ,检出率为 75%。此PCR检测方法的建立 ,为 M.

绵羊肺炎支原体和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

为建立同时检测绵羊肺炎支原体(MO)和溶血性曼氏杆菌(Mh)的方法,本研究根据MO的hsp70基因和Mh的gcp基因分别设计引物,建立了同时检测这两种病原的双重PCR检测方法。实验结果显示该方法能够特异性的扩增MO(135 bp)和Mh(227 bp)DNA片段,其最低检出量分别为2.06×103拷贝/μL和6.37 cfu/mL,与单一PCR相同。该方法对常见的致病菌无交叉反应。对临床样本的检测结果显示MO和Mh的检出率分别为56.25%和52.50%,与单独PCR符合率为100%。研究结果表明,本研究所建立的双重PCR检测方法具有特异性强、敏感性高等特点,为临床上MO和Mh混合感染的快速检测、鉴定以及流行病学调查提供了方便、快捷、准确的方法。

我国东北部分地区牛溶血性曼氏杆菌的分子流行病学研究

为了解牛溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)在我国牛群中的流行情况,本研究于2014年~2019年在东北部分地区采集健康牛、患病牛的鼻拭子和肺脏样品进行细菌的检测、分离和鉴定,并对分离株进行遗传进化分析。对牛溶血性曼氏杆菌的检测结果显示,不同年份、不同地区采集样品的总检出率为23.5%(28/119),其中健康牛的检出率为13.46%(7/52),明显低于临床发病或死亡牛样品的检出率31.34%(21/67)。采用特异性分型PCR检测发现,Mh分离株分为A1、A2和A6三个血清型,从健康牛分离的Mh株的主要血清型为A2型,而从发病或死亡牛主要分离的Mh是A1和A6型。遗传进化分析表明,A1和A6型分离株位于同一进化分支,菌株间16S rDNA和lktA基因的序列同源性均为100%;而它们与A2型分离株的亲缘关系较远,16S rDNA和lktA基因的序列同源性分别为99.8%~99.9%和85.8%~86.7%;此外,A1和A6型分离株的lktA同属于lktA1等位基因亚型,而A2型分离株属于lktA2和lktA8亚型,与A1和A6型相比呈现出较强的序列多样性。综上所述,Mh在我国东北部分地区牛群中的存在较为普遍,且A1和A6血清型是牛群中Mh的主要致病血清型。本研究获得的流行病学数据为我国牛群中溶血性曼氏杆菌的病原学以及疫苗研究提供科学依据。

林麝源化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

为快速准确检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌,分别根据化脓隐秘杆菌plo基因、溶血性曼氏杆菌ICEMh1基因和肺炎链球菌pspC基因的特异性序列设计引物和探针,以重组质粒a.p-m.h1-s.p为标准品,通过优化反应条件,建立一种检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌三重实时荧光定量PCR方法,对其特异性、灵敏度和可重复性进行测试。结果表明,建立的方法对标准品阳性质粒的最低检测量为20拷贝,标准曲线在1.25×10^6 copies/μL^1.0×101 copies/μL范围内具有良好的线性关系。对2016年-2018年在陕西省收集的病料中化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌检出率分别为66.67%、5.5%和44.44%。建立的三重实时荧光定量PCR方法能快速、准确和稳定地检测化脓隐秘杆菌、溶血性曼氏杆菌和肺炎链球菌。