一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶的Loop区域结构对酶活性的影响

利用大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统,成功异源表达并纯化了来自Pseudomonas syringae的一种周质甘糖醛酸C-5差向异构酶AlgG_PSEAM及其loop^(439-455)截短体。通过对产物进行分析发现,截去loop^(439-455)后,该甘露糖醛酸C-5差向异构酶的活性提高了14.7%。进一步分析,发现AlgG_PSEAM同时具有褐藻多糖裂解酶活性且通过测定其裂解酶活性发现,截去loop^(439-455)后,裂解酶活性提高了23.3%。截去loop^(439-455),可同时提高AlgG_PSEAM的甘露糖醛酸C-5差向异构酶和褐藻多糖裂解酶活性。

应用硫酸苯酚法建立一种甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性检测方法的研究

建立了一种简便快捷的甘露糖醛酸C-5差向异构酶活性的测定方法。研究发现相同分子质量的聚甘露糖醛酸和聚古罗糖醛酸与苯酚硫酸试剂反应后显色程度不同,以此可以用来测定β-D-甘露糖醛酸/α-L-古罗糖醛酸(M/G)值的变化,从而计算甘露糖醛酸C-5差向异构酶的活性。利用本方法测定了已知结构的褐藻胶片断的M/G比,其结果与传统的1H-NMR测定值基本一致。

利用DNA重组技术构建产生多聚甘露糖醛酸的突变菌株

本文旨在以海洋细菌Pseudomonas sp．QDA褐藻多糖（alginate）生物合成操纵元中的algG基因为靶点，利用DNA重组技术改建褐藻多糖的生物合成途径，以期获得产生甘露糖醛酸的突变菌株。首先，利用PCR克隆幽G基因两侧大小分别为1．7kb和1．8kb的DNA片段作为同源片段，用编码Gm抗性的aacCl基因替换algG基因，构建成打靶载体pEX100TUDG。将打靶载体转入QDA，利用Gm抗生素和蔗糖为选择压力进行培养，通过PCR和Southern杂交验证，获得了突变菌株。^1H—NMR、PAGE和GPC分析发现，突变菌株胞外产物为多聚甘露糖醛酸。该突变菌株的获得丰富了具有较高药物开发价值的甘露糖醛酸的来源，为褐藻多糖途径工程的进一步研究提供了理论依据和技术支持。