皱纹盘鲍脓疱病的组织学和超微结构研究

１９９３年９月以来，大连地区许多养鲍厂的皱纹盘鲍都发生了严重的脓疱病。通过病理组织切片研究证明，脓疱病的病灶是从鲍足下表面开始逐渐扩展向足的深部，由于该病的唯一病原菌———河流弧菌Ⅱ（ＶｉｂｒｉｏｆｌｕｖｉａｌｉｓⅡ）的大量繁殖使鲍足的结缔组织、肌纤维坏死瓦解或破碎，病灶中只剩下鲍的血淋巴细胞、弧菌及细胞碎片。从超微结构观察来看，早期病鲍足的肌原纤维排列混乱疏松，横纹肌的横纹模糊，继之细胞核肿大，核膜破裂，核质均质化，呈无结构状态，核仁消失，肌糖原消失，线粒体内嵴模糊，甚至破损。在晚期病灶中含有大量的河流弧菌Ⅱ，该菌呈短杆状，外壁薄，核区明显，胞质内含有颗粒（糖原）。该菌周围的组织被腐蚀成空斑。

皱纹盘鲍消化腺细胞类型和分泌产物

对皱纹盘鲍消化腺进行了组织学、组织化学、超微结构及酶活性测定等研究。消化腺由消化细胞和嗜碱性细胞组成。消化细胞能内吞腺管腔内的外源性物质 ,细胞内充满大量与异噬功能有关的囊泡。消化细胞具有内吞和细胞内消化、分泌、贮存等功能。嗜碱性细胞含有发达的粗面内质网以及许多含铁的折光小体 ,具有分泌和贮存金属离子的功能。消化腺还呈现多种水解酶活性。

皱纹盘鲍消化系统的组织学研究

利用光学显微镜观察研究了皱纹盘鲍的消化系统的组织学结构 .结果表明 :鲍的消化系统是由消化道 (口区、食道、嗉囊、胃盲囊、胃、肠、直肠、肛门 )、消化腺 (肝胰腺 )组成 .鲍的唇上皮由单层柱状细胞构成 ,细胞内充满着色素颗粒 ,唇内有纵横交错的肌纤维 ,其间有许多神经纤维分布 .其齿舌比较发达 ,齿舌囊的腹面正中线及其两侧分别有极发达的横纹肌肉块 .两侧的肌肉与包围齿舌软骨的肌肉群相汇合 ,其中绝大部分为纵肌 ,亦有少量环肌或斜肌 ,有利于摄食 .食道、嗉囊、胃盲囊、肠、直肠的结构基本相似 ,均由粘膜、粘膜下皮、肌层、外膜构成 ,与高等动物的类似 .肠粘膜下层发达 ,呈皱褶状向腔内突出 ,增大消化吸收的面积 .直肠的肌层发达有利于排遗 .鲍的消化腺主要由肝胰腺组成 .最外面为肝被膜 ,由单层立方上皮及其内的环肌层、结缔组织等构成 ,在结缔组织内含有小血窦 .肝小叶中的腺细胞交替进行分泌活动 .在分泌的细胞基部偶而可发现 1至几个染色较深的圆形细胞 ,核较大 ,内含 1个圆形核仁 ,我们称之为胚细胞 ,它可以补充分泌细胞的减少 .

皱纹盘鲍外套膜、鳃和足粘液细胞的类型与分布

以阿新兰和过碘酸雪夫氏反应 (AB PAS)染色法显微观察皱纹盘鲍 (Haliotisdiscushannai)的外套膜、鳃和足的粘液细胞。根据所显示颜色的不同 ,可将粘液细胞分为Ⅰ～Ⅳ 4种类型 :分别呈红色、蓝色、紫红色和蓝紫色。外套触手和外套膜上皮的粘液细胞以Ⅱ型为主 ,Ⅳ型较少 ,密度不均 ,多为近圆形细胞 ,大型和小型细胞均有分布。鳃轴和鳃叶上皮的粘液细胞密度较大 ,以Ⅱ型和Ⅰ型为主 ,Ⅲ型和Ⅳ型较少 ,形态有杯形、近圆形或棒状等 ,多为中型及小型细胞。足的上皮粘液细胞较少 ,均为Ⅱ型 。

三倍体皱纹盘鲍活体倍性鉴定——用上足触手、外套膜活体组织制备染色体标本

以上足触手、外套膜活体组织为材料 ,采用PHA体外浸泡法 ,运用正交实验设计 ,探讨了暂养温度、PHA(植物血球凝集素 )浓度及取材时间对细胞分裂频度的影响。根据直观分析 ,得出用上足触手、外套膜活体组织直接制备染色体标本进行三倍体皱纹盘鲍活体倍性鉴定的最优组合是 :暂养温度 2 0℃ ;PHA浓度为 1.0 0 % ;取材时间17:0 0～ 18:0 0。 3因素的主次顺序 :暂养温度→PHA浓度→取材时间。并可获得大量图像清晰、长度适中。

皱纹盘鲍齿舌形成的研究

LIU Chuan\|Lin CUI Long\|Bo LU Yao\|Hua) (Department of Biochemistry,Yantai University,Yantai 264005,Shandong, China)

皱纹盘鲍食道的结构与功能

以组织学、组织化学、扫描电镜和透射电镜观察及酶活性测定等方法研究了皱纹盘鲍的食道。食道可分为前、中、后三段 ,中段又可分为食物通道和食道侧囊。食道粘膜上皮由纤毛柱状细胞、粘液细胞、颗粒状腺细胞、微绒毛细胞和分泌细胞组成。纤毛柱状细胞参与运输食物和分泌物 ,并呈现吸收细胞的结构特征 ;粘液细胞分泌中性和酸性粘多糖 ;颗粒状腺细胞内充盈分泌颗粒 ;微绒毛细胞呈现吸收细胞的特征 ;分泌细胞具很强的蛋白酶等酶活性 ,能以顶浆分泌形式分泌消化酶 ,该细胞还具有吸收和细胞内消化作用。

幼龄皱纹盘鲍消化系统的组织学研究

以组织学方法研究了 4 5日龄皱纹盘鲍的消化系统 .消化道粘膜上皮呈扁平状、立方状或柱状 .食道可区分为 3段 ,食道侧囊有 3种细胞成分 .嗉囊比胃小 .肠有 5种细胞成分 .唾液腺由粘液细胞和纤毛细胞组成 .

皱纹盘鲍外套膜cDNA表达文库的构建

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannaiIno)的壳是生物矿化组织的杰出代表,其中的生物矿化蛋白质对其结构和性能发挥了关键性的作用。鉴于对皱纹盘鲍生物矿化功能基因信息研究的缺乏,文中采用SMART(Switching Mechanism At5’end of RNA Transcript)技术,构建皱纹盘鲍外套膜组织的全长cDNA表达文库。按Trizol试剂盒的操作程序提取皱纹盘鲍外套膜组织总RNA,以此为模板,通过PowerScript逆转录酶逆转录合成第一链cDNA;再以第一链cDNA产物为模板,用LD-PCR法合成双链cDNA。双链cDNA产物经SfiⅠ酶切和ChromaSpin 400柱分级分离后,与λTriplEx2载体进行连接,体外蛋白包装,即获得皱纹盘鲍外套膜cDNA原始文库。测定其滴度为1.2×106pfu/mL,重组率为95%。PCR扩增方法测得插入cDNA片段长度在0.5～2 kb之间,平均为1.4 kb。进行文库的扩增,扩增后的cDNA文库的滴度为4×109pfu/mL,重组率93.6%。

皱纹盘鲍外套膜的组织学研究

对皱纹盘鲍外套膜的组织学观察发现,外套膜主要由上、下表皮和其间的结缔组织组成。上、下表皮细胞可分为高柱状细胞、弱嗜碱性腺细胞和颗粒状腺细胞3种,结缔组织中富含纤维、血管和神经。聚合体细胞发育形成结缔组织中的粘液泡腺细胞。

皱纹盘鲍外套膜的亚显微结构

对皱纹盘鲍外套膜细胞亚显微结构观察表明:外套膜上表皮有柱状细胞、具成群线粒体细胞2种;下表皮有柱状细胞、具成群线粒体细胞、具大颗粒细胞以及高电子密度细胞4种。这些细胞游离端具微绒毛和大、小不等的分泌泡、颗粒,说明有吸收和分泌功能。结缔组织中除有成纤维细胞和颗粒细胞外还充满胶原原纤维和肌原纤维,无髓神经原纤维也较多。

皱纹盘鲍循环系统和排泄系统的组织学研究

对皱纹盘鲍的循环系统和排泄系统进行了组织学研究,并对二者组织学上的关系进行了探讨.结果表明:鲍循环系统由心脏、血管和许多血窦组成,属于开管式循环,血液由血浆和3种不同形态的血淋巴细胞构成.鲍的排泄系统主要由左右2个肾脏组成.肾脏呈囊状,由肾脏壁和肾实质构成,而肾脏壁由围心腔壁延伸而成,与围心腔壁具有几乎相同的结构.肾小管是肾实质的主要功能结构,由一层腺上皮细胞构成,肾小管之间充满血窦.循环系统与排泄系统组织结构上的紧密联系有利于代谢产物的排泄.

金属离子对皱纹盘鲍组织培养的影响

采用3因素3水平L9(34)的正交设计,以组织块增殖百分率作为评价指标,研究了在M199和RPMI-1640培养基中分别添加Ca2+,Mg2+,Zn2+金属离子对鲍的外套膜和上足触手组织培养的影响.结果显示,Ca2+和Zn2+对细胞增殖具有明显的促进作用,Mg2+的作用不明显;对上足触手细胞生长最好的组合为5 g/L的Ca2+,1 g/L的Mg2+,20μg/L的Zn2+;对外套膜细胞生长最好的组合为1 g/L的Ca2+,1 g/L的Mg2+,60μg/L的Zn2+.

皱纹盘鲍胚后消化系统发育的研究

以组织学、组织化学和透射电镜观察等方法研究了皱纹盘鲍自孵化后的担轮幼虫至1a龄幼鲍10个时期消化系统的胚后发育.食道于面盘幼虫早期出现;自围口壳幼虫食道中段的上皮细胞开始分泌蛋白酶;在上足分化幼体食道侧囊形成;在稚鲍,食道侧囊上皮分化成微绒毛细胞、分泌细胞和纤毛细胞.嗉囊直至稚鲍期才形成;在1a龄幼鲍,嗉囊腔大于胃腔.胃出现于面盘幼虫早期;到匍匐幼虫,胃腔出现单细胞藻.肠出现于面盘幼虫早期;在上足分化幼虫,肠上皮分化为纤毛细胞和微绒毛细胞两种细胞;在稚鲍肠上皮分化成纤毛细胞、微绒毛细胞、Ⅰ型腺细胞、Ⅱ型腺细胞和黏液细胞共5种细胞,肠沟出现.唾液腺形成于上足分化幼虫期.消化腺于面盘幼虫早期出现,自面盘幼虫中期开始分化成嗜碱性细胞和消化细胞.嗜碱性细胞的细胞质由嗜酸性逐渐转变为嗜碱性;至上足分化幼虫,细胞内出现含铁的折光小体.消化细胞自匍匐幼虫摄食起就出现内吞作用,细胞内含大量囊泡.研究表明,发育到稚鲍时,消化系统诸器官的结构和功能已基本接近成鲍.

皱纹盘鲍外套膜耐维生素E缺乏消减cDNA文库的构建

为了克隆维生素E缺乏时皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)外套膜差异性表达的基因,本研究配制了维生素E缺乏水平(3.5 mg/kg)和正常添加水平(52.8 mg/kg)的人工饲料,喂养皱纹盘鲍幼鲍,初始体质量为(0.71±0.00)g,初始壳长为(15.49±0.04)mm,240 d后,采用抑制消减杂交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了维生素E缺乏组与正常组外套膜组织差异表达的cDNA消减文库。经检验,差异表达的基因均被富集了25-28倍,证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。从文库中随机挑取100个白色克隆摇菌液进行PCR鉴定,95%的克隆中均有100-900 bp的插入片段,这些片段可能是维生素E缺乏差异表达基因的cDNA片段。选取含插入片段大小不同的48个克隆测序,其中有16个新基因,10个谷胱甘肽转移酶的基因,5个谷胱甘肽过氧化物酶基因,2个过氧化氢酶基因,3个羟基类固醇脱氢酶基因,4个酪氨酸激酶基因,1个类甲状腺过氧化物酶蛋白基因,3个纤维素酶基因,1个cAMP效应元件结合蛋白基因,3个贝壳生物矿化相关蛋白的基因。总的来说,利用抑制消减杂交的方法构建差异表达cDNA文库,可以比较好地反映维生素E对皱纹盘鲍影响的基因信息,为研究其他营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响提供了基础数据。

皱纹盘鲍贝壳沉积过程的研究

利用“平珠”生成法，通过对插入皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino）外套膜外腔中的玻片上沉积物质的分析，探讨皱纹盘鲍贝壳沉积的过程。利用扫描电镜（SEM）观察玻片上沉积物质的超微结构，傅立叶红外光谱（FTIR）分析玻片上沉积晶体的晶相，透射电镜（TEM）观察与玻片接触部分的外套膜的超微结构。结果发现：在将玻片插入外套膜外腔后的4～88h内．有机质首先在玻片上规则沉积。插入玻片88h后方解石晶体开始沉积，104h后出现圆形方解石晶体单位。8d后在方解石晶体表面出现文石晶体突起，15d后出现明显的堆垛型文石片层。27d后突然转变为方解石晶体的沉积。由此可见皱纹盘鲍贝壳的沉积具有一定的周期性，即方解石→文石→方解石的转变为1个周期。透射电镜观察外套膜结构表明在不同的插片时间，外套膜的超微结构不一样。插入玻片24h后．高柱状细胞中的内质网上的核糖体消失，高尔基体数量减少。3d后，大颗粒细胞增多，细胞内充满分泌颗粒。7d后，外套膜上皮细胞新分泌的有机质染色较浅。本研究证明了“平珠”生成法能够模拟贝壳的自然沉积，外套膜细胞超微结构的变化与贝壳沉积过程所处不同阶段有关。

速冻皱纹盘鲍的肌肉营养、蛋白组成及显微结构分析

为探究贝类冻品的营养成分及质地特性,以体质量为(11.42±0.29)g的速冻皱纹盘鲍Haliotis discus hannai为研究对象,对其主要可食部位闭壳肌和足肌的基本营养成分、氨基酸组成、蛋白分布和微观组织结构进行分析。结果表明:速冻鲍鱼肌肉中水分含量很高,达80%以上,其中,闭壳肌中粗蛋白质含量显著高于足肌(P<0.05),两者间粗脂肪含量无显著性差异(P>0.05)且远低于一般水产品;氨基酸分析显示,闭壳肌和足肌均含有丰富的赖氨酸与苏氨酸,但闭壳肌中氨基酸含量显著高于足肌(P<0.05);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析显示,两部分肌浆蛋白及胶原蛋白分布相似,而肌原纤维蛋白分布存在差异,只有闭壳肌部分在相对分子质量75000~180000间有可见条带;光学显微镜分析显示,闭壳肌中肌纤维排列呈交错状、纤维细短、空隙较小,而足肌中肌纤维呈平行排列、纤维粗长、空隙较大。研究表明,速冻鲍鱼的闭壳肌部分在营养成分、氨基酸含量和肌肉嫩度方面均优于足肌部分,为良好的蛋白摄入来源。

利用对虾消化腺丝氨酸蛋白酶制备鲍鱼外套膜ACE抑制肽

利用鲍鱼加工副产物外套膜制备具有抑制血管紧张素转移酶(angiotensin converting enzyme,ACE)活性的生物活性肽,为鲍鱼加工副产物的高值化利用提供新思路。采用从凡纳滨对虾消化腺中制备的丝氨酸蛋白酶,酶解皱纹盘鲍外套膜蛋白,以酶解物ACE抑制活性为评价指标优化条件。酶解液通过3 kDa超滤膜后,活性组分经过Superdex peptide 10/300 GL凝胶过滤柱和反相高效液相色谱(reversed-phase high performance liquid chromatography,RP-HPLC)分离纯化,利用液相色谱-质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)鉴定纯化肽的氨基酸序列。结果显示,酶解液的ACE抑制率为13.42%,经3 kDa超滤膜初步分级后,相同浓度下,小于3 kDa的组分ACE抑制率为53.25%。经凝胶过滤柱和反相高效液相色谱柱进一步分离后,从ACE抑制活性最高的峰中鉴定得到5个肽段,序列为LGDSFYYGK、LVNEVTEFAK、VDEVGGEALGR、MFLSFPTTK、VATVSLPR,说明活性峰是多肽混合物。本研究利用鲍鱼外套膜制备ACE抑制肽,可以为鲍鱼及对虾加工副产物的高值化利用提供理论参考。

皱纹盘鲍心脏、肾脏、粘液腺和足的组织学研究

对皱纹盘鲍心脏、肾脏、粘液腺和足的组织学结构进行了研究。观察发现，鲍心室壁和心耳壁由外膜层和心肌层组成，心耳外膜形成囊泡状结构；肾实质由众多的肾小管及集合管组成；粘液腺由位于外套膜凹陷处的粗大粘液腺细胞组成；足由外至里的组织结构依次是表皮、皮下组织和肌组织，足底部和四周边缘的组织结构不尽相同。