FGF23、MEPE和sFRP4在肿瘤性骨软化症发病机制中的作用

目的探讨成纤维细胞生长因子-23（FGF-23）、细胞外基质磷酸糖蛋白（MEPE）和分泌型卷曲相关蛋白（sFRP4）在肿瘤性骨软化症（TIO）发病机制中的作用。方法TIO肿瘤8例（T1-T8），其他间叶肿瘤5例（C1-C5），低血磷骨软化症病人行股骨手术，病理为凝血坏死组织1例（P1），正常人骨骼、肌肉组织各2例（B1、B2、M1和M2）。RT-PCR检测组织中FGF23、MEPE、sFRP4 mRNA的表达，Western blot检测TIO肿瘤FGF23蛋白的表达。TIO 4例（T1、T3、T4和T7）及P1在手术前后分别取血测定血清磷和FGF23（ELISA）水平。结果TIO肿瘤有数量不等的FGF23和MEPE的mRNA表达，部分肿瘤表达sFRP4的mRNA。7／8例TIO肿瘤有不同强度FGF23蛋白表达。TIO术前血FGF23升高，术后2～24h降至正常；血磷3-10d缓慢升至正常，P1病人术后血FGF23无变化，血磷未上升。FGF23与MEPE mRNA正相关（r=0．884，P〈0．05），FGF23 mRNA与蛋白表达之间成正相关关系（r=0．921，P〈0．05）。结论FGF23是TIO发病的主要原因，MEPE在TIO肿瘤发病中起到一定作用，sFRP4的作用尚不明确。

MEPE／OF45蛋白的抗体制备与细胞内定位研究

目的研究MEPE/OF45蛋白(Matrix Extracellular PhosphoglycoprotEin/Osteoblast/Osteocyte Factor 45,MEPE/OF45)的功能,制备MEPE/OF45蛋白抗体并检测其定位。方法通过分子克隆方法体外表达MEPE/OF45蛋白片段,获得大量纯蛋白后免疫小鼠并得到抗体,利用抗体进行免疫荧光染色方法检测MEPE/OF45蛋白在细胞内定位情况。结果得到特异性较高的抗体,并观察到MEPE/OF45蛋白在辐射敏感细胞与抗辐射细胞内定位不同。结论MEPE/OF45蛋白不同辐射敏感型的细胞中定位不同,说明MEPE/OF45蛋白参与细胞辐射后DNA损伤修复过程。

转录因子c-Jun调控成骨细胞Mepe基因表达的研究

目的:探讨转录因子c-Jun对Mepe基因的转录调控作用,并寻找c-Jun在Mepe启动子上的特异性结合位点。方法:利用免疫组织化学方法定位c-Jun与Mepe在小鼠骨组织的表达;采用real-time PCR的方法检测c-Jun的表达量改变对Mepe mRNA表达的影响;应用双萤光素酶报告基因检测系统及定点突变技术分析c-Jun对Mepe基因启动子转录活性的影响。结果:转录因子c-Jun在小鼠骨细胞胞核中呈阳性表达,而Mepe在小鼠骨细胞的胞浆中有表达;real-time PCR显示c-Jun过表达后,Mepe mRNA的表达显著增加(P<0.05);双萤光素酶报告基因检测系统检测显示,在成骨细胞中转染p CMV-3Tag-1-c-Jun的实验组Mepe启动子的转录活性升高(P<0.05);定点突变c-Jun的潜在结合位点后,Mepe启动子的转录活性显著下降(P<0.05)。结论:转录因子c-Jun可通过Mepe启动子上潜在的c-Jun结合位点上调成骨细胞中该基因的转录。

细胞外基质磷酸化糖蛋白的研究现状

细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)定位于人类染色体4q21.1。由于MEPE在肿瘤相关性低磷性骨软化患者(OHO)的肿瘤组织中高表达,故其被认为是导致低磷性骨软化的调磷因子。MEPE主要表达于分化成熟的成骨细胞和骨细胞中,具有抑制骨形成和矿化的作用,是一种矿化抑制因子。在牙齿组织中,MEPE主要表达于成牙本质细胞,并与多种致病基因位于染色体4q21上的牙体硬组织疾病如釉质发育不全、Ⅱ和Ⅲ型牙本质发育不全有关。

重组人细胞外基质磷酸化糖蛋白对人牙髓细胞体外矿化的影响

目的:探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白(Matrix extracellular phosphogl ycoprotein,MEPE)对人牙髓细胞(human dental pulpcells,HDPCs)在体外的矿化能力的影响,从而了解该蛋白在牙齿生长发育过程中的作用。方法:常规方法培养获得人牙髓细胞,实验组中使用的MEPEs的浓度为100μg/L。通过Vonkossa染色观察MEPE对人牙髓细胞矿化的影响。结果:MEPE蛋白能促进人牙髓细胞的矿化。结论:MEPE具有促进人牙髓细胞的矿化的能力,可能在牙齿生长发育过程中起着重要的作用。

小分子整联蛋白结合配体N-连接糖蛋白家族成员在牙髓干细胞分化过程中的作用

体外诱导牙髓干细胞向成牙本质细胞分化并观察其过程,是目前研究牙髓干细胞分化机制和寻找其分化标志的主要方法。在成牙本质细胞分化和矿化过程中,小分子整联蛋白结合配体N-糖蛋白(SBLING)家族成员发挥着重要作用。下面就SBLING家族成员牙本质涎磷蛋白、牙本质基质蛋白-1和细胞外基质磷酸糖蛋白在牙髓干细胞分化过程中的作用作一综述。

小整联蛋白结合配体N-连结糖蛋白家族成员在牙发育中的作用

小整联蛋白结合配体N-连结糖蛋白家族是一组主要在牙和骨组织中表达的蛋白质,其基因具有通用的外显子内含子结构,影响细胞的增殖和分化。目前已知其包括骨桥蛋白、骨涎蛋白、牙本质基质蛋白-1、牙本质涎磷蛋白、细胞外基质磷酸糖蛋白和釉蛋白等6个成员,本文就其在牙发育过程中的作用作一综述。

靶向细胞外基质磷酸糖蛋白的microRNA的筛选及鉴定

目的:寻找靶向细胞外基质磷酸糖蛋白(MEPE)基因的微小RNA(miRNA),并检测其对人HeLa细胞内源性Mepe基因表达的影响。方法:通过NCBI检索人源Mepe的3'UTR,利用miRNA预测工具TargetScan预测可能靶向Mepe的所有miRNA,通过双萤光素酶报告基因系统检测miRNA与Mepe3'UTR的结合情况,从而初步筛选出可能靶向Mepe的miRNA;同时,用Western印迹检测miRNA经转染后对Mepe基因表达的影响。结果:利用TargetScan预测出36条可能靶向Mepe的miRNA,根据分值及匹配情况从中挑选出6条进行验证;与转染空载体pGL3-cm的相对荧光素值相比,转染miR-376a的相对荧光素值降低较为明显,而当Mepe3'UTR与miR-376a结合位点突变后,miR-376a不能抑制萤光素酶的活性;Western印迹结果显示miR-376a能明显抑制MEPE的表达。结论:miRNA-376a可能是靶向Mepe基因的miRNA,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。

人细胞外基质磷酸糖蛋白MEPE的表达纯化及抗体制备

目的原核表达、纯化人细胞外基质磷酸糖蛋白(Mepe)基因,并制备多克隆抗体。方法设计出扩增人Mepe全长基因的特异引物,通过PCR扩增出该基因片段,测序正确后插入到含GST基因的原核表达载体pGEX-KG中,以IPTG诱导表达,并经谷胱甘肽琼脂糖珠纯化融合蛋白;用纯化的蛋白免疫小鼠制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体的效价,Western印迹鉴定抗体的特异性。结果原核表达了人Mepe全长基因,纯化了MEPE蛋白,并获得了抗MEPE的多克隆抗体,抗体效价达到1∶25 600,Western印迹结果显示,该抗血清能够特异识别原核及真核细胞表达的MEPE蛋白。结论 MEPE蛋白能够诱导小鼠产生具有较高效价和特异性的多克隆抗体,为进一步研究MEPE的功能奠定了基础。

MEPE基因沉默对人牙髓细胞增殖与成牙本质分化的作用研究

目的:研究细胞外基质磷酸化糖蛋白(Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein,MEPE)基因沉默对人牙髓细胞(Human Dental Pulp Cells,hDPCs)增殖和成牙本质分化能力的影响,探讨其在牙髓损伤修复中的功能。方法:酶消化组织块法分离培养hDPCs,以lipo2000介导siRNA-hMEPE转染hDPCs,以阴性对照组和未转染组设为对照,1、3、5、7d后,CCK-8法检测细胞增殖情况;转染hDPCs后以矿化诱导液培养5、7、10d后,实时荧光定量RT-PCR检测骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、牙本质涎磷蛋白(Dentin Sialoph osph oprotein,DSPP)、骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)、Collagen I mRNA表达水平。结果:CCK-8结果显示Si-h-MEPE转染h DPCs 1d后OD值下降,3d时到达最低值,且均低于未转染组与阴性对照组,3d时差异有统计学差异(P<0.05),未转染组与阴性对照组中,OD值持续升高,7d时到达峰值,与各自组内其他时间点比较有统计学差异(P<0.05);ALP活性检测结果显示,Si-h-MEPE转染hDPCs 3d细胞OD值最低,且明显低于未转染组与阴性对照组(P<0.05),未转染组与阴性对照组hDPCs OD值呈现逐渐升高趋势,在7d时达到最大值(P<0.05)。Si-h-MEPE转染h DPCs 3d时BSP、DSPP、OCN、Collagen I mRNA的表达量均较未转染组与阴性对照组下调(P<0.05)。在未转染组中,BSP、DSPP、OCN、Collagen I mRNA水平持续升高,在7d时达最高值,与3d比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:MEPE基因瞬时沉默抑制h DPCs增殖、使BSP、DSPP、OCN、Collagen I基因表达下调,ALP活性降低,与未转染组与阴性对照组比较结果提示MEPE可能通过调控h DPCs的增殖和成牙本质分化能力,在牙髓损伤修复中发挥重要作用。

人细胞外基质磷酸化糖蛋白对人牙髓细胞生长和黏附的影响

目的探讨细胞外基质磷酸化糖蛋白(MEPE)对人牙髓细胞(HDPCs)黏附、伸展、增殖的影响。方法常规培养获得人牙髓细胞,各实验组中MEPEs的浓度分别为0.01,0.1,1,10,100μg/L以不加MEPE作为空白对照组。细胞计数法测定细胞的黏附能力;通过计数高倍视野中伸展的细胞数,计算骨髓基质细胞在不同时间的伸展率;MTT法检测各组细胞的增殖活性。结果体外培养的人牙髓细胞生长良好;各实验组间及与对照组比较,100μg/L组对细胞的黏附性的影响有差异;各组细胞的伸展率无差异;MEPE对人牙髓细胞有较明显的促增殖作用。结论 MEPE对体外培养的人牙髓细胞的伸展率无影响,但可明显促进其黏附性和增殖。

细胞外基质磷酸化糖蛋白在人牙髓细胞成牙本质分化中的表达

目的检测人牙髓细胞（human dental pulp cells，hDPC）诱导矿化过程中细胞外基质磷酸化糖蛋白（matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE）的表达变化，探讨MEPE在人牙髓细胞向成牙本质样细胞分化过程中的可能作用。方法酶消化法分离培养hDPC，取诱导前及矿化诱导7、14、21d的hDPC，实时荧光定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白质印迹法检测MEPE、牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）、牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）和I型胶原的表达，蛋白质印迹法检测蛋白表达。结果hDPC经矿化诱导，MEPE、DSPP、BSP和I型胶原mRNA表达呈时间依赖性上调，MEPE和BSP mRNA在诱导各时间点与对照组间的差异均有统计学意义（P〈0.001），DSPP和I型胶原的mRNA相对系数在诱导第21天分别为（12943.33±3805.73）和（250.55±31.86），与对照组间的差异均具有统计学意义（P〈0.05）。蛋白质印迹法检测显示各矿化标记的蛋白表达均较对照组上调。结论在hDPC诱导成牙本质分化的过程中，MEPE与DSPP、DSP、BSP、I型胶原呈现相似的表达变化趋势，提示MEPE与hDPC的成牙本质分化有关，可作为hDPC向成牙本质样细胞分化的标志。