鸡IL-18cDNA的克隆及在大肠杆菌中的高效表达

运用RT PCR方法,从经脂多糖(LPS)诱导的鸡马立克氏病成淋巴细胞样细胞系 MDCC MSB1 总 RNA中扩增得到了鸡白细胞介素18(Chicken interleukin 18,ChIL 18)成熟蛋白基因的 cDNA,并将其克隆到 pMD18 T载体上。DNA序列测定表明,克隆得到的ChIL 18 cDNA与国外报道的完全一致,包括终止密码子在内其编码区的长度为510bp,编码169个氨基酸残基的蛋白质。将ChIL 18 成熟肽段编码区定向克隆到原核表达载体 pGEX 6P 1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建成原核表达质粒 pGEX ChIL18。该质粒的 BL21(DE3)LysS转化菌在 IPTG的诱导下可高效表达GST ChIL18基因融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白的32%。

海兰鸡白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR方法从用植物血凝素(PHA)活化60日龄海兰鸡的脾脏淋巴细胞中扩增出海兰鸡白细胞介素18(IL-18)成熟蛋白基因的cDNA,并将其克隆到pGEM-T Easy Vector载体上,DNA序列测定表明,克隆得到的海兰鸡ChIL-18 cDNA基因全序列包括终止密码子在内其编码区大小为510 bp,编码169个氨基酸多肽.将该基因片段克隆到原核表达载体pQE30构建重组质粒pQE30-ChIL-18,转化大肠杆菌M15,并用IPTG诱导.重组菌菌体裂解物SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19 000的重组蛋白.

鸡IL-18成熟蛋白基因原核表达载体的构建及多克隆抗体的制备

应用RT-PCR技术得到鸡IL-18成熟蛋白基因(chicken mature interleukin-18),将克隆片段与原核表达载体pET28a+连接,构建了重组表达载体pET28a+-ChMIL18,转化至大肠杆菌BL21感受态细胞,获得重组表达菌株。经IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析后,用含有融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳颗粒免疫家兔,制备兔抗鸡IL-18多克隆抗体,Western-Blot检测抗体效价和特异性。结果表明,鸡IL-18在BL21中得到了表达,相对分子质量约为23kD,获得了具有较高效价的特异性多克隆抗体。为进一步研究鸡IL-18成熟蛋白的生物学活性和作用机制奠定了基础。

鸡白细胞介素18基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR技术直接从罗曼鸡脾脏提取的总RNA中扩增鸡白细胞介素18(ChIL-18)全基因,并克隆和测序得到序列基因全长为597 bp的ChIL-18。将ChIL-18成熟蛋白编码区(510 bp)定向插入到原核表达载体pGEX-4T-1中谷胱甘肽转移酶(GST)基因的下游,构建重组表达质粒pGEX-ChIL-18,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下可高效表达融合蛋白(GST-ChIL-18)。SDS-PAGE可检测到分子质量约为46 kDa的GST-ChIL-18。Western blot证实GST-ChIL-18能与鸡IL-18单克隆抗体发生特异性反应。融合蛋白GST-ChIL-18经谷胱苷肽Seph-arose-4B亲和柱层析纯化后明显促进鸡T淋巴细胞转化,表明所表达的ChIL-18具有一定的生物活性。

鸡白细胞介素18成熟蛋白的原核表达及抗体间接ELISA方法的建立

将鸡白细胞介素18的成熟蛋白(chicken interleukin 18 mature protein,mChIL-18)基因在原核系统表达,采用Ni-NTA亲和层析方法纯化得到该重组蛋白。纯化后重组蛋白包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、羊抗鼠酶标二抗稀释倍数,建立检测ChIL-18成熟蛋白抗体的间接ELISA方法。经方阵滴定结果确定最佳抗原包被质量浓度为4μg/ml,阳性血清稀释比例为1∶104,羊抗鼠IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释比例为1∶12 000,抗原抗体最佳结合时间是1.5 h,血清与二抗最适反应时间为1 h。阴性、阳性血清的判定标准为:被检样本的OD值是一组阴性样本OD值的2或3倍且OD450≥0.5,即为阳性,比值以P/N表示1,.5<P/N<2.0为可疑,P/N<1.5为阴性。本试验结果证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,为下一步单抗的筛选鉴定奠定了必要的基础。

鸡白细胞介素18双抗体夹心ELISA检测方法的建立及初步应用

应用识别不同表位的鸡白细胞介素18成熟蛋白(Mature chicken interleukin-18,mChIL-18)的2株单克隆抗体(mAb)1G9和2E6,建立检测mChIL-18的双抗体夹心ELISA,并利用此方法对禽网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)人工感染SPF鸡体内mChIL-18的分泌水平进行检测。结果显示,捕获抗体的最佳质量浓度为8mg/L,检测抗体的工作效价为1∶800,待检样品的最佳稀释度为1∶400,检测敏感度可达31.5ng/L,与其他细胞因子等抗原蛋白无交叉反应;跟对照组相比,REV感染鸡体内mChIL-18的表达量在7、14、21、28、35、42、49d均呈现升高,但只有14日龄时表现差异显著(P<0.05)。结果表明,本试验成功建立了ChIL-18的双抗体夹心ELISA,为鸡传染病的细胞免疫学研究提供了可靠方法。