毒素蛋白基因mazF在基因修饰系统中的应用进展

毒素-抗毒素系统(Toxin-antitoxin system,TA系统)存在于大部分细菌中。mazEF是大肠杆菌中一种毒素-抗毒素系统。毒素基因mazF编码的MazF毒素蛋白可以特异性地剪切自由mRNA的ACA序列,从而抑制蛋白合成、引起细胞生长停滞;近些年,许多学者利用mazF基因作为反向筛选标记对不同种微生物建立了无标记或无痕的基因修饰系统,并实现了不同菌株的基因组修饰。主要综述了大肠杆菌mazF基因作为反向筛选基因的应用原理及其在不同种类微生物的基因修饰系统中的应用进展,然后对mazF基因及其他毒素基因在基因修饰系统中的应用进行了展望。

结核分枝杆菌MazF5毒素蛋白的生物信息学分析

目的 探究结核分枝杆菌MazF5蛋白的结构与功能。方法 从NCBI数据库获得编码MazF5基因信息及氨基酸的序列;运用Expasy的ProtParam应用插件分析蛋白理化性质;运用ProtScale、SignalP 4.1、TMHMM Serverv.2.0、NetPhos 3.1、YinOYang 1.2软件分别预测蛋白的亲疏水性、信号肽、跨膜区、磷酸化位点及糖基化位点;运用SOMPA、SWISS-MODEL软件分别预测蛋白的二级和三级结构;运用DoGSiteScorer软件预测蛋白的小分子结合口袋;运用STRING数据库分析MazF5互作蛋白;运用BioEdit软件分析氨基酸序列同源性;运用ABCpred和SYFPEITHI对蛋白的B、Th、CTL细胞抗原表位进行预测。结果 MazF5蛋白分子式为C_(510)H_(866)N_(158)O_(149)S_7,所含原子数为1 690,由109个氨基酸组成。预测的等电点PI为9.00,半衰期为30 h,脂溶性指数是113.58,不稳定指数为51.82,为不稳定蛋白。此外,MazF5蛋白无信号肽、为非跨膜蛋白、拥有多个磷酸化及糖基化位点,二级结构中无规则卷曲含量最多。同时,它含有多个小分子结合区域,并能与MazE5、MazF3、MazF6、MazF9等多个蛋白相互作用。氨基酸序列同源性分析结果显示结核分枝杆菌与卡内特分枝杆菌同源性较高。MazF5蛋白还具有多个B、T细胞优势抗原表位。结论 MazF5蛋白存在多个位点和抗原表位,存在蛋白相互作用网络,具有多个小分子结合位点,是潜在的结核病检测血清标志物。

CRISPR-Cas9系统与mazF介导的大片段删减法在酿酒酵母染色体大片段删减中的比较

【目的】比较CRISPR-Cas9系统与maz F法这两种酿酒酵母染色体大片段删减方法。【方法】分别用上述两种方法删减了酿酒酵母长度为26.5 kb的染色体大片段YKL072W-YKL061W,并比较了两种方法的转化效率、敲除成功率。【结果】利用CRISPR-Cas9系统平均得到5个转化子,但正确率为100%;maz F法得到约100个转化子,正确率略低于前者,为93%。【结论】两种方法均能高效删减酿酒酵母染色体大片段,CRISPR-Cas9系统正确率较高,操作简便省时;maz F法相对稳定,对目的基因无PAM位点要求。

依赖HIV-1Tat的毒素蛋白MazF表达系统的建立

目的 建立HIV-1 Tat依赖的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR系统.方法 分别扩增HIV-1 U3TAR和MazF基因片段,通过重叠PCR将U3TAR和MazF连接起来,并TA克隆到pMD18T载体中.通过PCR为MazF引入HA标签,获得U3TAR-MazF-HA.经过双酶切和连接反应,将U3TAR-MazF-HA反向插入到pcDNA3.1,获得pcDNA3.1-HA-MazF-U3TAR.将GFP基因正向插入到MazF基因之后,为该载体引入了荧光报道基因,获得pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR.结果 与pcDNA3.1-tat-flag的共转染实验证明,构建的MazF表达载体pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR是Tat依赖的.对比pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR单转染的细胞,共转染的细胞具有更少的绿色荧光信号,表明表达的MazF可以下调报道基因GFP的表达.结论 pcDNA3.1-GFP-HA-MazF-U3TAR的构建,为探索基于MazF的艾滋病基因治疗方案提供了载体工具.

重组人胸腺肽串联基因的高效表达

人胸腺肽α1串联合成在表达载体p ET22b(+)上并进一步构建p Cold II(sp-4)-3 Tα表达质粒,在单一蛋白的Maz F表达系统中进行表达,组氨酸亲和层析纯化,最终获得纯化的单一可溶性胸腺肽。

用于枯草芽孢杆菌的反选改造方法

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是微生物发酵中应用最广泛的一种微生物,其在酶类生产中的应用已经实现工业化,具有重要的工业应用价值。本文简要介绍了三种构建转化质粒反选盒子的方法,其不仅具有简单高效,能够进行连续的基因插入操作,同时还具有定点突变、大片段删除以研究未知基因的功能等特点,因此具有很广泛的研究和应用前景。

一种谷氨酸棒杆菌基因无痕敲除载体的构建及应用

以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)23604编码赖氨酸胞内转运蛋白基因lys P为敲除对象,利用重叠PCR技术将lys P基因的上下游同源臂融合,并构建了由木糖启动子P_(xyl)和毒素蛋白基因maz F组成的筛选盒,同时无缝克隆连接至带有卡那霉素抗性基因的p TOPO载体中,经电转化及两次同源单交换筛选,实现lys P基因的无痕敲除。结果表明,经过卡那霉素抗性筛选、木糖二次筛选及基因组PCR鉴定后,成功获得lys P基因缺失菌株C.glutamicum 23604Δlys P;发酵后C.glutamicum 23604Δlys P赖氨酸产量较对照菌株产量提高了10.8%。该实验以大肠杆菌毒素蛋白基因maz F作为反向筛选标记的敲除载体,实现谷氨酸棒杆菌lys P的高效敲除;lys P基因的敲除使得赖氨酸不能进入胞内而在胞外积累,从而达到增产赖氨酸的目的。

结核枝杆菌中毒素-抗毒素系统的鉴定

【目的】鉴定结核分枝杆菌基因组上MazF同源蛋白基因与其上游基因是否组成毒素-抗毒素系统,阐明毒素蛋白的作用机理,并初步探讨毒素-抗毒素系统在营养缺乏时的表达调控。【方法】在大肠杆菌和耻垢分枝杆菌中将MazF同源蛋白单独表达或与其对应的抗毒素蛋白共同表达,鉴定MazF同源蛋白对细菌生长的抑制作用以及其对应的抗毒素蛋白能否消除这种生长抑制;通过体外RNA切割实验,检测MazF同源蛋白是否具有RNA切割活性;检测正常生长条件下和饥饿条件下毒素-抗毒素系统的启动子活性,探讨其在应激条件下的表达调控。【结果】结核分枝杆菌MazF同源蛋白中,Rv0659c、Rv1495和Rv1942c不具有抑制细菌生长的毒素蛋白活性,Rv1991c、Rv2801c、Rv1102c和mtPemK能够抑制细菌生长,而且它们的抑制作用可以分别被其对应的抗毒素Rv1991a、Rv2801a、Rv1103c和mtPemI解除。Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c具有RNA切割活性,mtPemK则不能切割RNA。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统的启动子在饥饿条件下活性显著升高。【结论】结核分枝杆菌基因组上Rv1991a-1991c、Rv2801a-2801c、Rv1103c-1102c和mtPemI-mtPemK是毒素-抗毒素系统。毒素蛋白Rv1991c、Rv2801c和Rv1102c通过切割RNA发挥抑菌或杀菌活性,mtPemK具体作用机理目前还不清楚。Rv1991a-1991c和Rv2801a-2801c系统可能参与结核分枝杆菌在营养匮乏条件下的生长调控。