牦牛MDHⅠ基因多态性及其与生长性状的关联分析

本研究旨在探讨牦牛细胞质苹果酸脱氢酶(cytoplasmic malate dehydrogenase,MDHⅠ)基因的遗传多态性及其与生长性状的关联性,以期为牦牛优良性状选育提供参考依据。选取5个牦牛类群(共178头),采集耳组织样提取DNA并构建DNA池,对MDHⅠ基因所有外显子设计特异性引物进行扩增测序,用Mega 5.2筛查SNPs位点,直接测序法鉴定其基因型,利用PopGene 32进行χ^2独立性检测、基因纯合度(Ho)、基因杂合度(He)、有效等位基因频率(Ne)和多态信息含量(PIC)分析,利用SPSS 24.0分析MDHⅠ基因与牦牛生长性状间的关联性。结果表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均在外显子8区域发现1个突变位点(G23093C),属同义突变,有3种基因型:GC、CC和GG,5个牦牛类群中,GC基因型为优势基因型(类乌齐牦牛中GG为优势基因型),G为优势等位基因(斯布牦牛除外),在斯布牦牛中,G和C基因频率相等。χ2适应性检验表明,申扎牦牛、类乌齐牦牛、斯布牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。MDHⅠ基因在申扎牦牛、帕里牦牛和斯布牦牛中属于高度多态(PIC>0.5),在麦洼牦牛和类乌齐牦牛中属于中度多态(0.25<PIC<0.5);纯合度最高的是申扎牦牛和类乌齐牦牛。关联性分析结果表明,MDHⅠ基因不同基因型对类乌齐牦牛、帕里牦牛和麦洼牦牛体重有显著性影响(P<0.05);且种间分析发现,MDHⅠ基因不同基因型对牦牛体重有显著性影响(P<0.05),说明该基因可作为人工选育的分子标记。

牦牛MDHⅡ基因克隆表达及脂代谢候选基因关联性分析

旨在通过克隆牦牛MDHⅡ基因,探究其组织表达谱及与脂代谢候选基因的相关性,为进一步研究牦牛脂代谢机制提供基础数据。采集0.5,2.5,3.5,7.5岁4个年龄段的12头牦牛心脏、肝脏、肺脏、臀肌和臀脂组织总RNA并反转录成cDNA,实时荧光定量检测MDHⅡ表达量;随机选取12个与脂代谢相关的候选基因,采用实时荧光定量检测MDHⅡ在类乌齐牦牛臀肌、臀脂上的表达量,利用皮尔森系数法计算其与MDHⅡ基因表达量相关性。结果表明:牦牛MDHⅡ基因全长1 196 bp,CDS区长为1 017 bp,编码338个氨基酸,在进化上相对不保守;随年龄增长,MDHⅡ在各组织表达量下降,且在心脏上的表达量高于其他组织;除FABP2和VLDLR外的其余10个脂代谢候选基因在牦牛臀脂上的表达量均高于臀肌,MDHⅡ基因在臀肌上的表达量与脂代谢候选基因没有相关性,在臀脂上的表达量与CPT1基因呈显著负相关。本研究成功克隆得到牦牛MDHⅡ基因,其与脂代谢候选基因CPT1显著相关,推测该基因可能参与脂代谢调控,为进一步研究牦牛脂代谢机制提供了理论参考。

利用CRISPR/Cas9技术构建MDH2敲除细胞株及抗呕吐毒素效应研究

试验旨在利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建稳定敲除苹果酸脱氢酶2(malate dehydrogenase 2,MDH2)基因的IPEC-J2单克隆细胞株,并研究敲除MDH2基因后抗呕吐毒素效应。针对MDH2基因序列设计sgRNA插入PX459载体中,构建PX459-sgRNA-MDH2重组质粒;将质粒通过电转导入IPEC-J2细胞中,并加入嘌呤霉素筛选阳性细胞;利用有限稀释法筛选单克隆细胞并进行基因型测序鉴定、荧光定量PCR和蛋白质印迹法验证,获得MDH2基因敲除的单克隆细胞株;最后通过CCK8试剂盒和细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测细胞存活情况,测定MDH2敲除细胞株对呕吐毒素的抗性。测序结果显示MDH2基因敲除载体构建成功。利用荧光定量PCR及蛋白免疫印迹法验证了获得的细胞系为MDH2基因敲除的单克隆细胞株。CCK8细胞活力实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2可使IPEC-J2细胞在不同浓度呕吐毒素(4、2、1和0.5μg/mL)处理5 d时细胞活力分别极显著提高18.67%、19.59%、26.36%和27.01%。流式细胞仪实验结果显示,与野生型细胞相比,敲除MDH2使不同浓度呕吐毒素处理5 d的细胞死亡率分别极显著降低30.33%、15.81%、16.00%和14.70%。利用CRISPR/Cas9系统对IPEC-J2细胞中的MDH2基因进行敲除并筛选获得了MDH2-KO单克隆细胞株,并通过细胞活力和细胞死亡检测,证明该细胞株具有抗呕吐毒素毒性效应的效果,为揭示呕吐毒素诱导宿主细胞死亡的毒性机制提供借鉴,为防治呕吐毒素提供新策略。

共表达PDI1、MDH1和HAC1基因对重组毕赤酵母分泌表达葡糖氧化酶的影响

葡糖氧化酶(GOD)可催化葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸,在工业上被广泛应用。在构建的一株整合多拷贝GOD基因且含有HAC1表达单元的重组毕赤酵母G/GMH1的基础上,共表达分子伴侣二硫键异构酶基因PDI1和苹果酸脱氢酶基因MDH1,考察PDI1、MDH1基因与HAC1共表达后对GOD分泌表达的影响。这些基因共表达后对重组菌的生长无明显影响。PDI1和MDH1分别与HAC1共表达后,重组菌G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1的胞外GOD产量达到11731.9U/g DCW和11047.6U/g DCW,比出发菌提高了17.3%和10.4%,前者达到了目前所报道摇瓶培养的最高单位菌体酶活水平。而三基因共表达重组菌G/GMH1-PDI1-MDH1的GOD产量略有下降。在所构建的菌株中,GOD基因的转录水平仅在G/GMH1-PDI1-MDH1中略有提高,与酶产量的提高无直接关系。与出发菌相比,共表达基因的转录水平在新构建的菌中有不同程度的升高,说明这些基因被成功转录。PDI1和MDH1基因转录在G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1中分别被上调,可能与GOD产量提高有关。虽然GOD、HAC1、PDI1和MDH1基因在G/GMH1-PDI1-MDH1中均被上调,但并未促进酶产量的提高。

霍乱弧菌DPO-PCR特异性检测方法的建立与应用

采用一种新型的引物设计方法——双启动寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide,DPO),以霍乱弧菌mdh基因为靶序列,建立了霍乱弧菌DPO-PCR特异性检测方法,分析了DPO引物退火温度不敏感性、检测灵敏度及特异性,并对检测方法进行了初步应用。灵敏度结果显示,DPO-PCR方法对霍乱弧菌的最低检出限为1.07×102 CFU/mL。退火温度不敏感性试验中,与常规PCR引物相比,DPO引物在45～65℃退火温度均能够高效扩增出靶基因片段。特异性结果显示,DPO-PCR方法的特异性比常规PCR方法强,不产生任何非特异性扩增。利用建立的霍乱弧菌DPO-PCR检测方法对采集的550份样本进行检测,检出43份霍乱弧菌阳性样本,经行业标准法(SN/T2425-2010)复检,检测结果相同,表明所建立的DPO-PCR检测方法具有良好的实用性,为霍乱弧菌的快速准确检测提供了新途径。

霍乱弧菌环介导等温扩增LAMP技术检测

目的应用环介导等温扩增技术(LAMP)进行霍乱弧菌的快速检测。方法针对霍乱弧菌的管家基因(mdh)设计4条特异性引物(2条内引物和2条外引物),建立快速检测食品中霍乱弧菌的环介导等温扩增方法;应用该方法对17种细菌共42株菌进行LAMP扩增,并进行确证,全面评估该方法的灵敏度、特异性、准确性等。结果该方法检测21株霍乱弧菌均得到阳性扩增结果,其余21株非霍乱弧菌均未扩增出条带,扩增反应最佳反应时间为60m in,反应温度为65℃。霍乱弧菌基因组DNA和纯培养物的检测灵敏度分别约为40 fg和50 cfu/mL。对模拟食品样品进行直接检测,检测限为70 cfu/g。结论该方法具有特异性强、灵敏度高,操作简便快速、不需要复杂仪器设备。

DNA环介导恒温扩增技术快速检测霍乱弧菌

霍乱弧菌是一种重要的食源性致病菌,主要引起急性肠道传染病,其快速检测具有重要意义。根据霍乱弧菌的mdh管家基因序列,设计2对特异性检测引物,利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),经反应体系优化,成功建立了霍乱弧菌的LAMP快速检测方法。该方法最佳反应温度为65℃,60min完成检测,对培养菌的检测限为25CFU/mL,污染食品中霍乱弧菌的检测限为32CFU/g。对33株同种或近源细菌进行LAMP检测,仅霍乱弧菌得到阳性扩增。LAMP方法实践应用结果表明,对1057份虾、蟹、牡蛎、肉类、人腹泻物等样本进行检测,共检出85份阳性,与国际标准(ISO TS21872-1-2007)检测结果的符合率为100%。结果表明,本研究建立的霍乱弧菌LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、操作简便,有利于霍乱弧菌疫情的监测。