Mdx小鼠骨骼肌纤维化及Spp1基因表达

目的通过观察Duchenne型肌营养不良的模型鼠mdx小鼠骨骼肌中纤维化情况,研究Spp1基因在mdx小鼠及其对照鼠中不同时期的表达,探讨在mdx小鼠中Spp1与肌纤维化的关系。方法选取雄性C57BL/10Sc Sn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,雄性C57BL/6Sc Sn小鼠为对照组,根据年龄分为2w组、4w组、8w组、12w组。每组选取6只,3只用于冰冻切片的苏木精-伊红染色及马松(masson)染色,3只用于基因芯片及q RT-PCR。结果 2w及4w时mdx小鼠无明显结缔组织增生,8w时,mdx小鼠可见轻度结缔组织增生;12w时,mdx小鼠结缔组织增生程度较8w稍加重,仍为小片状区域的纤维化,对照组小鼠不同时期均未见纤维化;mdx小鼠2w与12w股四头肌基因芯片表达谱对比,其中Spp1基因在mdx小鼠2w与12w相比fold-change值为-15.1354,变化明显;Spp1在mdx小鼠股四头肌不同时期表达量比较:8w组较4w组明显升高,12w组较8w组表达量下降,但仍高于4w组,8w组与12w组Spp1表达量较同期对照组明显升高,差异具有统计学意义。结论 mdx小鼠早期(2w^4w)肌纤维化表现不明显,8w时骨骼肌内可见少量结缔组织增生,随后缓慢进展。2 Spp1基因在mdx小鼠成熟期(8w^12w)表达量明显增加,推测其在mdx小鼠肌纤维化中发挥一定作用。

mdx小鼠骨骼肌组织成肌、成脂、成骨基因的特异性表达

背景:干细胞移植是治疗肌营养不良症的有效方法之一,但移植的干细胞在病理骨骼肌中成肌表达较低。目的:通过比较mdx小鼠和C57小鼠的骨骼肌形态及成肌、成脂、成骨基因表达的差异,探讨mdx小鼠骨骼肌病理改变的可能机制。方法:取mdx小鼠与C57小鼠的骨骼肌组织行冰冻切片,苏木精-伊红染色和Vonkossa染色观察两种小鼠肌肉组织的形态特征;提取mdx小鼠和C57小鼠骨骼肌组织总RNA,real-timePCR检测成肌、成脂、成骨相关基因的表达。结果与结论:mdx小鼠骨骼肌有肌纤维坏死和再生,伴有轻度脂肪、纤维结缔组织增生,Vonkossa染色可见钙结节沉积,而C57小鼠的骨骼肌细胞形态清晰,核位于细胞周边。与C57小鼠比较,mdx小鼠肌肉组织成骨、成脂基因表达有不同程度的上调(P<0.05),而成肌基因表达下调(P<0.05)。dystrophin基因缺失及成肌基因表达下调、成骨和成脂基因上调是造成mdx小鼠肌肉组织变性坏死的原因。

Mdx小鼠骨骼肌中炎症反应和mpeg1的表达

目的探讨mdx小鼠不同时期骨骼肌的炎性病理改变,观察mpeg1在mdx小鼠及对照鼠中的表达。方法选取雄性C57BL/10ScSn-Dmdmdx/JNju鼠为实验组,对照组为雄性C57BL/6Sc Sn小鼠,根据年龄分为2 w、4 w、8 w、12 w 4个亚组。通过HE染色、MGT染色、ACP染色观察骨骼肌光镜下的形态学改变,总结mdx小鼠骨骼肌炎性病理变化。通过RNA提取,基因芯片的检测及mpegl的qRT-PCR检测,观察mpeg1的表达情况。结果常规组织染色中,2 w的mdx小鼠肌肉偶见高度浓染的肌纤维,未见肌细胞坏死,炎症细胞浸润,4 w可见巨噬细胞吞噬现象散在分布,8 w时炎细胞浸润灶融合成片,12 w时炎性病灶面积减小;利用基因芯片技术筛选出mdx小鼠中有关炎症反应的基因30余个,结果显示与2 w相比,炎症反应相关基因表达量均增加,在8 w时达到峰值,12 w有所下降,但较2 w时仍有升高;qRT-PCR结果显示从4 w开始,mdx小鼠中mpeg1的含量逐渐增加,8 w时含量最高。结论 (1)炎症反应参与mdx小鼠疾病的发生发展:从2 w开始出现,8 w达到高峰,12 w趋于平稳;(2)Mpeg1在mdx小鼠炎症反应中发挥了一定的作用。

DMD免疫缺陷型小鼠模型的建立及其基因型鉴定

目的建立假肥大型肌营养不良症(DMD)免疫缺陷型小鼠(scid/mdx双基因缺陷型,scid-/-/mdx-/-),以及其抗肌萎缩蛋白基因(dystrophin)和scid基因的PCR鉴定方法。方法利用经典遗传学的杂交-互交方法,将非糖尿病-严重联合免疫缺陷(NOD-scid)雄鼠(scid-/-)和mdx雌鼠(mdx-/-)进行交配,提取杂合子F2代小鼠的基因组DNA,对dystrophin以及scid基因进行片段扩增,电泳后观察结果。结果46只杂合子F2代小鼠中共鉴定出13只dystrophin和scid双基因缺陷型的纯合小鼠,将人骨髓间充质细胞移植入小鼠,能整合分化成骨骼肌细胞。结论实验成功的得到了DMD免疫缺陷型小鼠,并提供了一种简单快速准确的PCR鉴定方法,为DMD的实验研究中的异种间移植提供了有效的动物模型。

mTOR调控自噬在Duchenne肌营养不良症肌纤维损害中的研究

目的探索哺乳动物雷帕霉素靶点(mTOR)相关自噬调节通路在mdx小鼠骨骼肌纤维中有关线粒体形态学异常以及肌肉萎缩和坏死过程中所处的地位和作用.方法选取8 w龄雄性mdx小鼠为实验组,同龄C57小鼠为对照组,每组各3只,取股四头肌组织,通过病理染色观察肌肉组织病理学改变,应用电镜技术观察线粒体的形态变化,应用免疫荧光染色技术观察自噬泡标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和线粒体标志物电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel,VDAC)的共定位情况,利用Western blot技术分析mTOR相关自噬调控通路蛋白的表达,应用Real-Time PCR技术分析自噬相关基因的表达水平.结果与对照组相比,8w龄mdx小鼠股四头肌组织萎缩,肌纤维内可见核内移、肌再生及炎性细胞浸润;电镜下可见线粒体体积变小,数量增多,并出现线粒体肿胀、嵴消失现象.免疫荧光可见线粒体标记物VDAC和自噬泡标记物LC3的团块状聚集,两者的共定位增加.自噬相关基因蛋白及基因表达上升、线粒体自噬相关基因明显上升,mTOR通路下游相关基因蛋白表达水平下降.结论8w龄mdx小鼠股四头肌组织内肌纤维存在变性和坏死,线粒体形态学异常.mTOR的活性降低,自噬相关蛋白表达水平升高,该阶段自噬通路处于激活状态.

补肾方辅助骨髓干细胞移植治疗DMD的实验研究

目的:观察补肾方辅助骨髓干细胞移植治疗mdx小鼠的效果。方法:体外培养正常C57BL/6小鼠骨髓细胞对放疗后mdx小鼠尾静脉移植,用补肾方水提液灌胃实验鼠,观察实验小鼠存活率和移植物抗宿主病(GVHD)症状;移植后4个月/8个月取小鼠骨骼肌以HE染色观察病理状况,以免疫荧光方法检测细胞骨架蛋白(DYS蛋白)表达。结果:补肾方能不同程度降低mdx鼠核中心移位比例和提高DYS蛋白表达量;同时能明显减轻GVHD症状。结论:补肾方能提高骨髓干细胞移植治疗mdx小鼠的效果。

骨髓胚胎样干细胞体内重建dystrophin的表达

目的观察骨髓胚胎样干细胞体内再生dystrophin的可行性。方法采用SSP-PCR方法鉴定mdx小鼠的基因型。分离扩增人骨髓胚胎样干细胞,采用DIR标记后,注射细胞到mdx小鼠腹股沟三角皮下,采用活体成像法观察植入细胞的存活情况,采用免疫荧光染色法检测dystrophin的表达。结果杂合子鼠交配可以产生3个基因型的子代鼠,采用SSP-PCR可以鉴定出mdx小鼠基因型;采用无血清培养基可从骨髓中分离到表达SSEA-4和FZD-9的胚胎样干细胞,可在注射细胞的mdx小鼠离体后肢肌肉检测到明显的荧光信号,并在肌肉组织中检测到人dystrophin的表达。结论人骨髓胚胎样干细胞可在mdx小鼠体内存活并表达dystrophin。

糖皮质激素治疗Duchenne型肌营养不良机制的实验研究

目的:对应用糖皮质激素(glucocorticoid,GC)治疗Duchenne型肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy,DMD)的机制进行探讨。方法:应用DMD动物模型mdx小鼠进行实验,将模型组随机分为3组,Mdx模型组(6周龄)、Mdx安慰剂组(12周龄)、Mdx GC治疗组(12周龄),每组8只,另取正常C57小鼠,6周龄和12周龄各8只,作为正常对照组,分别进行悬吊实验,测量时间,观察治疗前后时间变化;测量血清CK值,了解肌肉损伤情况;对所分离的腓肠肌进行HE染色,在电镜下观察病理变化;检测肌肉中Utrophin蛋白表达状况,应用Western blot进行检测,同时获得核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、I-κB、热休克蛋白70(heat shak protein,HSP70)蛋白表达水平,采用独立样本t检验、方差分析(多重比较)和配对t检验统计方法发现与前者关系所在。结果:GC治疗实验动物出现明显变化,与安慰剂相比具有差异明显:(1)Mdx小鼠与治疗前相比肌力明显好转;治疗前悬吊实验时间为(22±11)s,治疗后为(43.8±24.9)s,P<0.001,CK值下降明显,治疗前为(20 230±2 444)U/L,治疗后为(6 457±2 215)U/L,P<0.001;(2)Mdx小鼠腓肠肌电镜下进行细胞学观察,发现较前明显好转;(3)Mdx小鼠肌肉组织中HSP70蛋白表达水平明显增加,OD比值由治疗前0.50±0.09上升至治疗后0.75±0.09,P<0.001,而Utrophin蛋白表达从0.23±0.03上升至0.42±0.08,P=0.003,NF-κB蛋白表达由治疗前0.33±0.04下降至0.26±0.02,P<0.001,治疗前后I-κB蛋白表达由0.21±0.06变至0.18±0.05,P=0.372。结论:应用GC治疗后HSP70表达增强,NF-κB活性下降,Utrophin表达增加,从而使Mdx小鼠的肌肉病变有所延缓,肌力增加。

MSC介导CD30L等4种炎症相关因子在治疗DMD中发挥作用

目的研究m UCMSC移植治疗DMD标准模型mdx小鼠后炎症相关因子变化,探讨MSC治疗DMD相关机制。方法 PCR鉴定出mdx小鼠随机分为两组:生理盐水组和治疗组;另取正常C57小鼠作为正常对照组。治疗组腹腔注射m UCMSC的生理盐水细胞悬液,生理盐水组和对照组输入等体积生理盐水,检测血清CK值;对各组小鼠的腓肠肌进行HE染色,显微镜下观察病理变化并计数CNF;采集mdx小鼠腓肠肌组织用QAM-INF-1蛋白芯片测定小鼠肌组织炎症因子含量。结果治疗组与生理盐水组相比具有差异明显:(1) Mdx小鼠血清CK值生理盐水组为(1374. 60±127. 13) U/L,治疗组为(434. 60±19. 39) U/L,显著低于生理盐水组(P <0. 05);(2)治疗组mdx小鼠腓肠肌切片显示细胞间炎性细胞浸润减轻,细胞大小趋于统一,核中心移位现象减少;(3)生理盐水组mdx小鼠腓肠肌细胞CNF可达(94. 37±11. 65)%,治疗组CNF为(80. 37±7. 65)%,显著减少(P <0. 05);(4) mdx小鼠后肢腓肠肌组织中CD30L、IL-21、MIP-1a、PF4含量明显较低(P <0. 05)。结论 m UCMSC治疗后,腓肠肌组织中CD30L IL-21、MIP-1a、PF4含量较低,血清CK值降低,细胞损伤减少。肌组织炎症表现减轻,在m UCMSC治疗DMD中发挥作用。

成肌细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症的实验研究

目的研究成肌细胞移植治疗假肥大型肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy,DMD)的效果,探讨基因治疗DMD的方法及可行性。方法用多步酶消化法与差速贴壁法培养C57/BL10小鼠成肌细胞,倒置相差显微镜观察细胞形态。取第4代细胞用5-BrdU标记。将24只DMD模型鼠——mdx小鼠(4～6周龄,雄性,体重13.8～24.6g)随机分为两组(n=12),A组经尾静脉分2次(间隔2周)注射1×106个/mL标记后成肌细胞,B组同法注射1mLDMEM/F12培养基为对照。术后4周采用一次性游泳力竭实验检测小鼠运动能力,处死后取材行HE染色及5-BrdU、结蛋白、抗肌萎缩蛋白(dystrophin,Dys)免疫组织化学染色观察,并行图像分析。结果原代成肌细胞培养5～7d后即可传代,可获得稳定传代及足量的细胞。A组小鼠一次性游泳力竭时间为(60.72±5.76)min,B组为(47.77±5.40)min,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。术后4周HE染色示A组可见变成圆形且透明染色的肌细胞,肌纤维细胞核中心移位(centrally nucleated fibers,CNF)比例为67%;B组肌纤维粗细不等,可见肥大、萎缩、变性和肌纤维坏死等改变,CNF比例>80%。免疫组织化学染色示,A组5-BrdU、结蛋白、Dys表达均呈阳性,B组少见表达或呈阴性表达。图像分析结果显示,A、B组结蛋白积分吸光度(IA)值分别为489.70±451.83和71.15±61.14,阳性面积占视野总面积的比值分别为0.3143±0.1973和0.1028±0.0628(P<0.05);DysIA值分别为5424.64±2658.01和902.12±593.51(P>0.05),阳性面积占视野总面积的比值分别为0.3237±0.1177和0.0352±0.0329(P<0.05)。结论成肌细胞移植治疗小鼠DMD有一定的治疗作用。