Med19基因敲减增加乳腺癌细胞化疗敏感性及其可能的机制

目的:研究中介体(mediator,Med)19对乳腺癌化疗敏感性的影响并分析其分子机制。方法:选用多柔比星(adriamycin,ADM)耐药的人乳腺癌细胞MCF-7/ADM和亲本细胞MCF-7(NC组),采用慢病毒载体介导RNA干扰方法构建Med19稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株(KD组),并用Real-time PCR和Western blotting方法验证干扰效果。CCK-8法检测慢病毒介导的Med19敲减前后两种细胞对ADM、顺铂(cisplatin,DDP)和紫杉醇(taxinol,TAX)药物敏感性的变化。Real-time PCR和Western blotting检测Med19敲减对多药耐药基因1(multidrug resistance 1,MDR1)和细胞凋亡基因Bcl2、Bax及Caspase-3、active Caspase-3的表达的影响。流式细胞术检测敲减Med19及ADM处理对细胞凋亡的影响。结果:与MCF-7相比,MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP和TAX均具有耐药性。成功构建Med19稳定低表达的MCF-7/ADM与MCF-7细胞株,并且其对ADM、DDP、TAX的敏感性增加,药物作用IC_(50)显著降低(均P<0.05)。MCF-7/ADM细胞Med19 mRNA和蛋白表达显著高于MCF-7细胞,Med19的敲减可降低MCF-7/ADM细胞中MDR1 mRNA与蛋白表达水平(均P<0.05)并可增加MCF-7/ADM及MCF-7细胞中凋亡相关active Caspase-3、Bax的蛋白表达,降低Bcl2的蛋白表达(均P<0.05)。此外,与NC及NC+ADM组相比,KD组及KD+ADM组凋亡水平显著增加(均P<0.05)。结论:Med19高表达参与乳腺癌化疗耐药,其机制可能与Med19调节MDR1的表达并影响细胞凋亡有关。

Med19基因沉默对p53野生型和突变型乳腺癌细胞紫杉醇化疗疗效的影响

目的:探讨下调中介体（mediator,Med）19表达是否增加紫杉醇（pacliatxel,PTX）对p53野生型和突变型乳腺癌细胞化疗的疗效。方法:构建Med19 RNA干扰（RNAi）慢病毒,分别感染p53野生型的乳腺癌细胞MCF-7和p53突变型的乳腺癌细胞MDA-MB-231,两种细胞均分为Med19基因敲减组（KD组:细胞感染pGcscil-Med19-si RNA-GFP）、空载体感染组（NC组:细胞感染pGcscil-Med19-NC-GFP）、对照组（CON组:未感染慢病毒的乳腺癌细胞）,荧光显微镜观察慢病毒感染效率。Western blotting检测Med19基因沉默后各组细胞内P53、磷酸化P53（p P53）、P21蛋白表达水平的变化。紫杉醇分别作用于Med19基因沉默前后的MCF-7和MDA-MB-231细胞,MTT法检测细胞增殖抑制率的变化,流式细胞术检测细胞周期和凋亡率的变化。结果:KD组和NC组细胞的荧光感染效率均大于90%,表明获得了满意的感染效率。与CON组和NC组相比,两种细胞KD组的Med19蛋白表达水平均下降,差异有统计学意义（均P<0.05）。MCF-7细胞KD组P53、p P53、P21蛋白表达上调,差异有统计意义（均P<0.05）。在0.0150μg/ml范围内,紫杉醇抑制两种乳腺癌细胞的生长增殖并呈浓度依赖性（P<0.05）,对KD组的抑制率和细胞凋亡率均高于NC组及CON组,差异有统计学意义（均P<0.05）;但MDA-MB-231细胞各组间抑制率差异无统计学意义（均P>0.05）。10μg/ml紫杉醇导致两种细胞的KD组和NC组均出现G2/M期阻滞,并且MCF-7细胞KD组G0/G1期细胞较NC组显著增加（P<0.05）。结论:Med19基因沉默增强紫杉醇对p53野生型乳腺癌MCF-7细胞化疗的疗效,其机制可能为增强了p53基因的表达活化,通过其下游基因p21调节细胞周期、促进细胞凋亡。